Inafasiriwa moja kwa moja kutoka kwa Wikipedia ya Kiingereza na Tafsiri ya Google

Polymerase mnyororo mmenyuko

Mstari wa mihuri nane ya PCR, kila mmoja ana mchanganyiko wa mmenyuko 100 μl

Mfumo wa polymerase mnyororo ( PCR ) ni mbinu inayotumiwa katika biolojia ya Masi ili kuongeza nakala moja au nakala chache za sehemu ya DNA kwa amri kadhaa za ukubwa, na kuzalisha maelfu kwa mamilioni ya nakala za mlolongo fulani wa DNA . Ni njia rahisi, nafuu, na ya kuaminika ya kuandika mara kwa mara sehemu iliyolenga ya DNA, dhana ambayo inatumika kwa maeneo mengi katika biolojia ya kisasa na sayansi zinazohusiana. [1]

Iliyoundwa mwaka wa 1983 na Kary Mullis , [2] [3] PCR sasa ni mbinu ya kawaida na ya kawaida inayotumiwa katika maabara ya kliniki na utafiti kwa ajili ya aina mbalimbali za maombi. [4] [5] Hizi ni pamoja na DNA cloning kwa sequencing , cloning gene na manipulation, gene mutagenesis; ujenzi wa phylogenie ya DNA, au uchambuzi wa kazi za jeni ; utambuzi na ufuatiliaji wa magonjwa ya urithi ; amplification ya DNA ya kale; [6] uchambuzi wa vidole vya kidole kwa maelezo ya DNA (kwa mfano, katika sayansi ya uchunguzi na kupima wazazi ); na kutambua vimelea katika majaribio ya asidi ya nyuklia kwa ajili ya ugonjwa wa magonjwa ya kuambukiza . Mnamo 1993, Mullis alipewa Tuzo ya Nobel katika Kemia pamoja na Michael Smith kwa kazi yake kwenye PCR. [7]

Kuweka mstari wa zilizopo nane za PCR kwenye baiskeli ya joto

Mbinu nyingi za PCR hutegemea baiskeli ya mafuta , ambayo inahusisha kuwaeleza majibu ya mizunguko ya joto na kurudia mara kwa mara, kuruhusu athari tofauti za joto-tegemezi-hasa, DNA ya kuyeyuka na enzyme -kutajwa kwa DNA-kurudia mara nyingi kwa mlolongo. Vitambaa (vipande vifupi vya DNA) vyenye mlolongo unaohusiana na mkoa wa lengo, pamoja na DNA polymerase , baada ya njia hiyo inaitwa, huwezesha kukuza na kukuza mara kwa mara. Kama PCR inavyoendelea, DNA inayozalishwa yenyewe hutumiwa kama template kwa ajili ya kujibu, ikitengenezea mmenyuko wa mnyororo ambayo template ya awali ya DNA imeonyeshwa kwa kiasi kikubwa . Unyenyekevu wa kanuni ya msingi inayozingatia PCR ina maana kuwa inaweza kubadilishwa sana kutekeleza safu nyingi za maumbile ya maumbile . PCR sio kawaida kuchukuliwa kama njia ya DNA iliyo na recombinant , kwa sababu haihusishi kukata na kudumisha DNA, tu kuimarisha utaratibu uliopo.

Karibu programu zote za PCR zinatumia DNA polymerase iliyo imara joto, kama vile Taq polymerase , awali ya enzyme iliyotengwa na bia ya thermophilic Thermus aquaticus . DNA polymerase inakusanya dhamana mpya ya DNA kutoka kwa nucleotides ya bure, vitengo vya DNA, kwa kutumia DNA moja iliyopangwa kama template na oligonucleotides ya DNA (primers zilizotajwa hapo juu) kuanzisha awali DNA.

Katika hatua ya kwanza, vipande viwili vya DNA mbili helix vinatenganishwa kimwili kwa joto la juu katika mchakato unaoitwa DNA ya kuyeyuka . Katika hatua ya pili, joto hupungua na vile vile DNA mbili hupanda kuwa templates kwa DNA polymerase ili kuchagua kikamilifu DNA ya lengo. Uteuzi wa matokeo ya PCR kutoka kwa matumizi ya primers ambayo ni ya ziada ya mlolongo karibu na mkoa DNA walengwa kwa amplification chini ya maalum hali ya baiskeli hali.

Yaliyomo

Kanuni ya

Baiskeli ya mafuta kwa PCR
Mfano wa zamani wa joto la joto la cycler kwa PCR

PCR inaongeza kanda maalum ya mkondo wa DNA (lengo la DNA). Mbinu nyingi za PCR zinaimarisha vipande vya DNA kati ya jozi ya msingi ya kilo 0.1 na 10 (kbp), ingawa baadhi ya mbinu zinaruhusu kuimarisha vipande hadi ukubwa wa kbp 40. [8] Kiasi cha bidhaa iliyopanuliwa imedhamiriwa na substrates inapatikana katika majibu, ambayo huwa na kiwango kikubwa kama majibu yanaendelea. [9]

Uwekaji wa msingi wa PCR unahitaji vipengele kadhaa na reagents, [10] ikiwa ni pamoja na:

  • template DNA ambayo ina eneo DNA lengo ili kuongeza
  • DNA polymerase , enzyme inayozalisha mipaka mpya ya DNA; Taq polymerase isiyo na sugu ni ya kawaida, [11] kwa sababu inawezekana zaidi kubaki wakati wa mchakato wa joto la DNA
  • Vipengele viwili vya DNA ambavyo vinazingatia mwisho wa 3 ' (tatu mkuu) mwisho wa kila nadharia na kupambana na hisia za DNA lengo (DNA polymerase inaweza tu kumfunga na kupanua kutoka kanda mbili iliyopigwa kwa DNA; bila primers huko hakuna tovuti ya uanzishwaji mara mbili ambayo polymerase inaweza kumfunga); [1] primers maalum ambayo ni inayosaidia eneo la DNA lengo ni kuchaguliwa kabla, na mara nyingi hufanya desturi katika maabara au kununuliwa kutoka kwa wauzaji wa biochemical kibiashara
  • deoxynucleoside triphosphates , au dNTPs (wakati mwingine huitwa "deoxynucleotide triphosphates"; nucleotides yenye vikundi vya triphosphate), jengo la ujenzi ambalo DNA polymerase hufanya synthesi mpya ya DNA
  • ufumbuzi wa buffer kutoa mazingira yanayotakiwa ya kemikali kwa shughuli bora na utulivu wa DNA polymerase
  • cations bivalent , kawaida magnesiamu (Mg) au manganese (Mn) ions; Mg 2+ ni ya kawaida, lakini Mn 2 + inaweza kutumika kwa mutagenesis ya DNA iliyoingiliana na PCR , kama msongamano mkubwa wa Mn 2 + unaongeza kiwango cha kosa wakati wa awali wa DNA [12]
  • cations monovalent , kawaida ionasi (K) ions

Menyukio hufanyika kwa kiasi cha 10-200 μl katika zilizopo ndogo za majibu (kiasi cha 0.2-0.5 ml) katika baiskeli ya joto . Mpira wa baiskeli ya mafuta hupunguza majibu ya majibu ili kufikia joto linalohitajika kila hatua ya majibu (angalia chini). Baiskeli nyingi za kisasa za mafuta hutumia athari ya Peltier , ambayo inaruhusu inapokanzwa na baridi ya kuzuia kushikilia zilizopo za PCR tu kwa kugeuza sasa umeme. Vipimo vya mmenyuko vyema vinaruhusu conductivity nzuri ya mafuta ili kuruhusu usawa wa haraka wa mafuta. Wengi baiskeli ya mafuta wana vifuniko vya joto ili kuzuia condensation juu ya tube mmenyuko. Vikanda vya zamani vya joto havipo kifuniko cha moto huhitaji safu ya mafuta juu ya mchanganyiko wa mmenyuko au mpira wa nta ndani ya bomba.

Utaratibu wa

Kwa kawaida, PCR ina mfululizo wa mabadiliko ya kawaida ya joto 20-40, inayoitwa mzunguko, na kila mzunguko unao na hatua mbili za joto za kawaida (tazama sura hapa chini). Baiskeli mara nyingi hutanguliwa na hatua moja ya joto kwenye joto la juu sana (> 90 ° C (194 ° F), na kufuatiwa na moja kushikilia mwishoni kwa ugani wa mwisho wa bidhaa au uhifadhi mfupi. Joto kutumika na urefu wa muda wao kutumika katika kila mzunguko hutegemea vigezo mbalimbali, ikiwa ni pamoja na enzyme kutumika kwa awali DNA, ukolezi wa ions bivalent na dNTPs katika mmenyuko, na joto ya kiwango ( Tm ) ya primers . [13] Hatua za kibinafsi za kawaida kwa njia nyingi za PCR ni kama ifuatavyo:

  • Initialization : Hatua hii inahitajika tu kwa DNA polymerases zinazohitaji uanzishaji wa joto na PCR ya moto-kuanza . [14] Inajumuisha inapokanzwa chumba cha majibu kwa joto la 94-96 ° C (201-205 ° F), au 98 ° C (208 ° F) ikiwa polymerases yenye nguvu sana hutumiwa, ambayo hufanyika kwa 1- dakika 10.
  • Denaturation : Hatua hii ni tukio la kwanza la baiskeli la kawaida na lina joto la chumba cha majibu hadi 94-98 ° C (201-208 ° F) kwa sekunde 20-30. Hii inasababisha DNA ya kuyeyuka , au kutenganisha, ya template ya DNA iliyopigwa mara mbili kwa kuvunja vifungo vya hidrojeni kati ya besi za ziada, na kutoa molekuli mbili za DNA zilizopigwa.
  • Annealing : Katika hatua inayofuata, joto la mmenyuko hupungua hadi 50-65 ° C (122-149 ° F) kwa sekunde 20-40, kuruhusu kuunganisha nyongeza kwa kila template za DNA zilizopigwa. Vipande viwili tofauti ni kawaida pamoja na mchanganyiko wa mmenyuko: moja kwa kila moja ya vipindi viwili vilivyo na kamba ambavyo vina eneo la lengo. Vipezo ni mfululizo wa moja kwa moja, lakini ni mfupi zaidi kuliko urefu wa kanda lengo, inayosaidia mwongozo mfupi tu katika mwisho wa 3 wa kila strand.
Ni muhimu kuamua joto sahihi kwa hatua ya annealing kwa sababu ufanisi na ufanisi huathirika sana na joto la annealing. Joto hili lazima liwe chini ya kutosha kuruhusu uchanganuzi wa primer kwenye kamba, lakini juu ya kutosha kwa ajili ya uchangamfu kuwa maalum, yaani, primer inapaswa kumfunga tu kwa sehemu kamilifu ya kifungo, na mahali popote. Ikiwa hali ya joto ni ndogo sana, primer inaweza kumfunga bila ukamilifu. Ikiwa ni ya juu sana, primer haiwezi kumfunga wakati wote. Kiwango cha joto cha annealing ni karibu 3-5 ° C chini ya Tm ya vitambaa vilivyotumiwa. Vifungo vya hidrojeni imara kati ya besi za ziada hutengenezwa tu wakati mlolongo wa kwanza unafanana sana na mlolongo wa template. Wakati wa hatua hii, polymerase imefungwa kwa mseto wa template-template na huanza malezi ya DNA.
  • Upanuzi / upungufu : joto la hatua hii linategemea DNA polymerase kutumika; optimum shughuli joto kwa Taq polima ni wastani 75-80 ° C (167-176 ° F), [15] [16] ingawa joto la 72 ° C (162 ° F) hutumiwa na enzyme hii. Katika hatua hii, DNA polymerase inaunganisha dhamana mpya ya DNA inayoongezea daktari ya DNA template kwa kuongeza dNTPs bure kutoka mchanganyiko wa mmenyuko ambayo ni complementary template katika 5'-to-3 'mwelekeo, condensing kundi 5'- phosphate ya dNTPs na kikundi cha 3'- hydroxy mwishoni mwa mkondo wa DNA (wa kutosha). Wakati sahihi unaohitajika kwa upungufu unategemea wote juu ya DNA polymerase kutumika na kwa urefu wa mkoa wa lengo la DNA ili kuimarisha. Kama kanuni ya kidole, kwa joto lao mojawapo, wengi wa DNA polymerases hupunguza besi elfu kwa dakika. Chini ya hali bora (kwa mfano, ikiwa hakuna mapungufu kutokana na kupunguzwa substrates au reagents), kwa kila hatua ya upanuzi / upanuzi, idadi ya utaratibu wa DNA lengo ni mara mbili. Kwa kila mzunguko wa mfululizo, template ya awali huweka pamoja na vipande vilivyotengenezwa hivi karibuni kuwa template huweka kwa mzunguko wa pili wa upungufu, na kusababisha uelezeo wa kielektroniki (kijiometri) wa mkoa maalum wa DNA.
Mchakato wa denaturation, annealing na elongation hufanya mzunguko mmoja. Mizunguko ya mara nyingi inahitajika ili kuimarisha lengo la DNA kwa mamilioni ya nakala. Fomu iliyotumiwa kuhesabu idadi ya nakala za DNA zilizoundwa baada ya idadi fulani ya mizunguko ni 2 n , ambapo n ni idadi ya mizunguko. Kwa hiyo, majibu yaliyowekwa kwa mzunguko wa 30 hupata matokeo ya 2 30 , au 1073741824, nakala za eneo la awali la DNA iliyopangwa mara mbili.
  • Kipindi cha mwisho : Hatua moja ni ya hiari, lakini inafanyika kwa joto la 70-74 ° C (158-165 ° F) (kiwango cha joto kinahitajika kwa shughuli bora ya polymerases wengi kutumika katika PCR) kwa dakika 5-15 baada ya Mzunguko wa mwisho wa PCR ili kuhakikisha kwamba DNA iliyobaki ya moja iliyopigwa imewekwa kikamilifu.
  • Mwisho wa kushikilia : Hatua ya mwisho inafuta chumba cha majibu hadi 4-15 ° C (39-59 ° F) kwa muda usio na kipimo, na inaweza kutumika kwa kuhifadhi muda mfupi wa bidhaa za PCR.
Kuchora kwa mkakati wa mzunguko kamili wa PCR
Bidhaa za PCR za kimudioni za bedidi baada ya electrophoresis ya gel . Seti mbili za primers zilizotumiwa ili kuimarisha mlolongo wa lengo kutoka sampuli tatu za tishu tofauti. Hakuna amplification iko kwenye sampuli # 1; Bendi za DNA katika sampuli ya # 2 na # 3 zinaonyesha kupanua mafanikio ya mlolongo wa lengo. Gel pia inaonyesha udhibiti mzuri, na ngazi ya DNA iliyo na vipande vya DNA ya urefu uliofafanuliwa kwa kupima bendi katika PCR za majaribio.

Kuangalia kama PCR imezalisha kwa ufanisi mkoa wa DNA lengo ambalo linajulikana (pia wakati mwingine hujulikana kama amplimer au amplicon ), electrophoresis ya gel ya agarose inaweza kutumika kwa ajili ya kujitenga ukubwa wa bidhaa za PCR. Ukubwa (s) wa bidhaa za PCR hutegemea kwa kulinganisha na ngazi ya DNA , alama ya uzito wa Masi ambayo ina vipande vya DNA ya ukubwa unaojulikana huendeshwa kwenye gel pamoja na bidhaa za PCR.

Tucker PCR

Hatua za

Kama ilivyo na athari nyingine za kemikali, kiwango cha majibu na ufanisi wa PCR huathiriwa na sababu za kupunguza. Hivyo, mchakato mzima wa PCR unaweza kugawanywa zaidi katika hatua tatu kulingana na maendeleo ya majibu:

  • Upeo wa ufanisi : Katika kila mzunguko, kiasi cha bidhaa ni mara mbili (kuchukua ufanisi wa mmenyuko wa 100%). Menyukio ni nyeti sana: tu dakika tu ya DNA lazima iwepo. [17]
  • Kupunguza hatua : mmenyuko hupungua kama DNA polymerase inapoteza shughuli na matumizi ya reagents kama vile dNTPs na primers huwafanya kuwa kikwazo.
  • Sanduku : Hakuna tena bidhaa inayojilimbikiza kutokana na uchovu wa reagents na enzyme.

optimization

Katika mazoezi, PCR inaweza kushindwa kwa sababu mbalimbali, kwa sehemu kutokana na uelewa wake kwa uchafuzi kusababisha kusababisha amplification ya bidhaa DNA hasira. Kwa sababu hii, mbinu na taratibu nyingi zimeandaliwa kwa ajili ya kuboresha hali ya PCR. [18] [19] Uharibifu wa DNA ya nje ni kushughulikiwa na taratibu za maabara na taratibu ambazo zinajumuisha mchanganyiko wa kabla ya PCR kutoka kwa uchafuzi wa DNA. [10] Hii mara nyingi inahusisha kutenganishwa kwa maeneo ya maeneo ya kuanzisha PCR kutoka maeneo ya uchambuzi au utakaso wa bidhaa za PCR, matumizi ya plastiki zilizopwa, na kusafisha kabisa kazi ya kazi kati ya seti za majibu. Mbinu za kuunda mapema ni muhimu katika kuboresha mazao ya bidhaa za PCR na kuzuia uundaji wa bidhaa zisizofaa, na matumizi ya vipengele vingine vya buffer au enzymes za polymerase zinaweza kusaidia kwa kuimarisha mikoa ya muda mrefu au tatizo la DNA. Uongeze wa reagents, kama vile formamide , katika mifumo ya buffer inaweza kuongeza maalum na mavuno ya PCR. [20] Simuleringar ya kompyuta ya matokeo ya PCR ya kinadharia ( Electronic PCR ) inaweza kufanywa ili kusaidia katika kubuni ya kwanza. [21]

Maombi

Kuchagua DNA kutengwa

PCR inaruhusu kutengwa kwa vipande vya DNA kutoka kwa DNA ya genomic kwa kuimarisha kanda maalum ya DNA. Matumizi haya ya PCR hutia njia nyingi, kama vile kuzalisha suluhisho za uchanganuzi kwa ajili ya uhamishaji wa Kusini na kaskazini na cloning ya DNA , ambayo inahitaji kiasi kikubwa cha DNA, inayowakilisha eneo la DNA maalum. PCR hutoa mbinu hizi kwa kiasi kikubwa cha DNA safi, kuwezesha uchambuzi wa sampuli za DNA hata kutoka kiasi kidogo sana cha nyenzo za kuanzia.

Matumizi mengine ya PCR yanajumuisha ufuatiliaji wa DNA kuamua utaratibu usiojulikana wa PCR ambao umbo la amplification linaweza kutumiwa katika ufuatiliaji wa Sanger, kutengwa kwa mlolongo wa DNA ili kuharakisha teknolojia za rekodi za DNA zinazohusisha kuingizwa kwa mlolongo wa DNA katika plasmid , phage , au cosmid (kulingana na ukubwa) au vifaa vya maumbile ya viumbe vingine. Makoloni ya bakteria (kama vile E. coli ) yanaweza kupimwa haraka na PCR kwa ajili ya ujenzi wa Vector sahihi wa DNA. [22] PCR inaweza pia kutumika kwa ajili ya uchapishaji wa kidole ; mbinu ya maandalizi ya kutumika kutambua mtu au kiumbe kwa kulinganisha DNA za majaribio kwa njia mbalimbali za PCR.

Njia za vidole vya PCR 'zina uwezo mkubwa wa ubaguzi na zinaweza kutumiwa kutambua mahusiano ya maumbile kati ya watu binafsi, kama vile mzazi-mtoto au kati ya ndugu, na hutumiwa katika kupima kwa uzazi (Kielelezo 4). Mbinu hii pia inaweza kutumiwa kuamua mahusiano ya mageuzi kati ya viumbe wakati baadhi ya saa za molekuli zinatumiwa (yaani, 16RRNA na jeni za ACA za microorganisms). [23]

Electrophoresis ya vipande vya DNA vilivyotengenezwa. (1) Baba. (2) Mtoto. (3) Mama. Mtoto amerithi baadhi, lakini sio alama zote za kidole za kila mmoja wa wazazi wake, akiwapa alama mpya za kidole.

Amplification na quantification ya DNA

Kwa sababu PCR inaongeza mikoa ya DNA ambayo inalenga, PCR inaweza kutumika kuchambua kiasi kidogo sana cha sampuli. Hii mara nyingi ni muhimu kwa uchambuzi wa uhandisi , wakati tu kiwango cha DNA kinapatikana kama ushahidi. PCR pia inaweza kutumika katika uchambuzi wa DNA ya kale ambayo ni maelfu ya miaka mingi. Mbinu hizi PCR makao kuwa mafanikio kutumika kwa wanyama, kama vile arobaini elfu na umri wa miaka mammoth , na pia juu ya DNA ya binadamu, katika maombi kuanzia uchambuzi wa Misri mummies kwa kutambua Russian Tsar na mwili wa Mfalme wa Kiingereza Richard III . [24]

Mbinu nyingi za PCR (qPCR) zinaruhusu uwiano wa kiasi cha mlolongo uliotolewa katika sampuli-mbinu mara nyingi hutumiwa kwa kiasi kikubwa kuamua ngazi za kujieleza kwa jeni . Vipimo vya PCR ni chombo kilichoanzishwa kwa upimaji wa DNA ambacho huchukua mkusanyiko wa bidhaa za DNA baada ya kila mzunguko wa amplification ya PCR.

qPCR inaruhusu upimaji na kugundua mlolongo maalum wa DNA kwa wakati halisi kwani huamua mkusanyiko wakati mchakato wa awali unafanyika. Kuna njia mbili za kugundua na kupimwa kwa wakati mmoja. Njia ya kwanza inajumuisha kutumia tezi za fluorescent ambazo zinahifadhiwa kwa kiasi kikubwa kati ya vipande viwili. Njia ya pili inahusisha probes kwamba kanuni kwa ajili ya utaratibu maalum na fluorescently marufuku. Kugundua DNA kwa kutumia mbinu hizi kunaweza kuonekana tu baada ya uchanganuzi wa probes na DNA yake ya ziada inafanyika. Mchanganyiko wa mbinu ya kuvutia ni PCR halisi ya wakati na kubadilisha upya (RT-qPCR). Mbinu hii ya kisasa inaruhusu kupimwa kwa kiasi kidogo cha RNA. Kupitia mbinu hii ya pamoja, mRNA inabadilishwa kwa cDNA, ambayo ni zaidi ya kuthibitishwa kwa kutumia qPCR. Mbinu hii inapunguza uwezekano wa makosa katika hatua ya mwisho ya PCR, [25] kuongeza nafasi ya kutambua jeni zinazohusiana na magonjwa ya maumbile kama kansa. [26] Maabara hutumia RT-qPCR kwa madhumuni ya kupima udhibiti wa jeni.

Maombi ya matibabu

Baada ya kukamilika kwa utaratibu wa genome ya kwanza mwaka 2000, Mradi wa Binadamu wa Genome [27] , PCR imetumika kwa idadi kubwa ya taratibu za matibabu:

  • Matumizi ya kwanza ya PCR ilitumiwa kwa ajili ya kupima maumbile , ambapo sampuli ya DNA ilikuwa kuchambuliwa kwa uwepo wa mabadiliko ya ugonjwa wa maumbile . [4] Wazazi wanaotarajiwa wanaweza kupimwa kwa kuwa na flygbolag za maumbile , au watoto wao wanaweza kupimwa kwa kuathiriwa na ugonjwa . Sampuli za DNA kwa ajili ya kupima kabla ya kujifungua zinaweza kupatikana kwa amniocentesis , chorionic villus sampuli , au hata kwa uchambuzi wa seli zisizo za fetasi zinazozunguka katika damu ya mama. Uchunguzi wa PCR pia ni muhimu kwa utambuzi wa maumbile kabla ya kuzalisha , ambapo seli za kibinafsi za kijivu zinazoendelea zinajaribiwa kwa mabadiliko.
  • PCR pia inaweza kutumika kama sehemu ya mtihani nyeti kwa kuandika tishu , muhimu kwa kupandikiza kiungo . Kuanzia mwaka wa 2008, kuna hata pendekezo la kuchukua nafasi ya vipimo vya kawaida vya antibody-msingi kwa aina ya damu na vipimo vya PCR-msingi. [28]
  • Aina nyingi za saratani zinahusisha mabadiliko ya oncogenes . Kwa kutumia vipimo vya PCR ili kujifunza mabadiliko haya, madawa ya kulevya yanaweza wakati mwingine kuwa maalum kwa kila mgonjwa. PCR inaruhusu utambuzi wa mapema ya magonjwa mabaya kama vile leukemia na lymphomas , ambayo kwa sasa ni ya maendeleo zaidi katika utafiti wa kansa na tayari imetumika mara kwa mara. Vipimo vya PCR vinaweza kufanywa moja kwa moja kwenye sampuli za DNA za genomic ili kuchunguza seli zinazosababishwa na translocation maalum kwa unyeti ambao ni angalau 10,000 zaidi kuliko ile ya njia nyingine. [29] PCR ni muhimu sana katika uwanja wa matibabu kwa sababu inaruhusu kujitenga na kupanua vidonda vya tumor. Vipimo vya PCR kwa mfano, vinaweza kutumika kupima na kuchambua seli moja, na kutambua DNA, mRNA na uthibitisho wa protini na mchanganyiko. [30]

.

Kuambukiza maombi

PCR inaruhusu ugonjwa wa kuambukiza kwa haraka na maalum sana, ikiwa ni pamoja na wale wanaosababishwa na bakteria au virusi. [31] PCR pia inaruhusu utambuzi wa microorganisms ambazo hazikulima au zinazoongezeka polepole kama vile mycobacteria , bakteria ya anaerobic , au virusi kutoka kwa majaribio ya utamaduni wa tishu na mifano ya wanyama . Msingi wa maombi ya uchunguzi wa PCR katika microbiolojia ni kutambua mawakala wa kuambukiza na ubaguzi wa yasiyo ya pathogenic kutokana na matatizo ya pathogenic kwa sababu ya jeni maalum. [31] [32]

Ufafanuzi na kutambua viumbe vya magonjwa yanayoambukiza vimebadilishwa na PCR kwa njia zifuatazo:

  • Virusi vya ukimwi (au VVU ), ni lengo lisilo la kupata na kukomesha. Majaribio ya awali ya maambukizi yalitegemea uwepo wa antibodies kwa virusi inayozunguka katika damu. Hata hivyo, antibodies hazionekani hadi wiki nyingi baada ya maambukizo, antibodies ya uzazi mask maambukizi ya mtoto mchanga, na mawakala wa matibabu kupambana na maambukizi hayaathiri antibodies. Majaribio ya PCR yameandaliwa ambayo yanaweza kuchunguza kama kidogo ya jeni moja ya virusi kati ya DNA ya seli zaidi ya 50,000 za jeshi. [33] Maambukizi yanaweza kupatikana hapo awali, damu inayopatiwa inaweza kuchunguzwa moja kwa moja kwa virusi, watoto wachanga wanaweza kupimwa mara moja kwa ajili ya maambukizi, na madhara ya tiba ya kuzuia maradhi yanaweza kuthibitishwa .
  • Baadhi ya viumbe vya ugonjwa, kama vile kwa kifua kikuu , ni vigumu kupima sampuli kutoka kwa wagonjwa na kupungua kwa kukua katika maabara. Vipimo vya PCR vimekubali kugundua idadi ndogo ya viumbe vya ugonjwa (wote wanaishi au wafu), katika sampuli zinazofaa . Uchunguzi wa kina wa maumbile pia unaweza kutumika kuchunguza upinzani wa antibiotic, kuruhusu tiba ya haraka na yenye ufanisi. Madhara ya tiba pia yanaweza kutathminiwa mara moja.
  • Kuenea kwa viumbe vya ugonjwa kwa njia ya wakazi wa wanyama wa ndani au wa mwitu unaweza kufuatiliwa na upimaji wa PCR. Mara nyingi, kuonekana kwa aina ndogo ndogo za virusi zinaweza kugunduliwa na kufuatiliwa. Aina ndogo za viumbe ambazo ziliwajibika kwa magonjwa ya mapema yanaweza pia kuamua na uchambuzi wa PCR.
  • DNA ya Virusi inaweza kuambukizwa na PCR. Vipande vilivyotumiwa vinapaswa kuwa maalum kwa utaratibu uliotengwa katika DNA ya virusi, na PCR inaweza kutumika kwa ajili ya uchunguzi wa uchunguzi au ufuatiliaji wa DNA wa jenasi ya virusi. Ukali wa juu wa PCR unaruhusu kugundua virusi mara baada ya kuambukizwa na hata kabla ya kuanza kwa ugonjwa. [31] Kugundua mapema kama hiyo kunaweza kuwapa madaktari wakati muhimu wa kuongoza. Kiasi cha virusi (" mzigo wa virusi ") katika mgonjwa pia inaweza kuthibitishwa na mbinu za uwiano wa DNA za PCR (angalia chini).

Maombi ya uandishi wa habari

Uendelezaji wa protocols za maumbile ya PCR (au DNA ) ya upeo wa kidole umeona maombi yaliyoenea katika forensics :

  • Katika fomu yake ya ubaguzi zaidi, uchapishaji wa kidole wa kizazi unaweza kuwa na ubaguzi wa pekee mtu yeyote kutoka kwa wakazi wote wa dunia . Sampuli za dakika za DNA zinaweza kutengwa na eneo la uhalifu , na ikilinganishwa na hilo kutoka kwa watuhumiwa, au kutoka kwenye databana ya DNA ya ushahidi wa awali au wafungwa. Matoleo mafupi ya vipimo hivi mara nyingi hutumiwa kuondokana na watuhumiwa haraka wakati wa uchunguzi wa makosa ya jinai. Ushahidi kutoka kwa uhalifu wa miaka mingi unaweza kupimwa, kuthibitisha au kuwatetea watu awali walihukumiwa.
  • Uandishi wa DNA wa uandishi wa habari umekuwa njia bora ya kutambua au kuhoji watuhumiwa wa makosa ya jinai kutokana na uchambuzi wa ushahidi uliopatikana kwenye eneo la uhalifu. Gome ya binadamu ina mikoa yenye kurudia ambayo inaweza kupatikana ndani ya utaratibu wa jeni au katika mikoa isiyo ya coding ya genome. Hasa, hadi 40% ya DNA ya binadamu ni kurudia. [34] Kuna makundi mawili tofauti ya mikoa hii ya kurudia, isiyo ya coding katika genome. Kipande cha kwanza kinachoitwa kurudia vigezo vya nambari ya variable (VNTR), ambazo ni jozi za msingi 10-100 kwa muda mrefu na kikundi cha pili kinachoitwa kurudia kwa muda mfupi (STR) na haya yanajumuisha sehemu mbili za jozi za msingi 2-10. PCR hutumiwa kuimarisha VNTR na majukumu kadhaa inayojulikana kwa kutumia vipaji vilivyomo kwenye mikoa ya kurudia. Ukubwa wa vipande vilivyopatikana kutoka kwa mtu yeyote kwa kila STR huonyesha ambayo vichwa vilivyopo. Kwa kuchunguza STR kadhaa kwa mtu binafsi, seti ya alleles kwa kila mtu itapatikana kuwa takwimu ni uwezekano kuwa kipekee. [35] Watafiti wamegundua mlolongo kamili wa genome ya binadamu. Mlolongo huu unaweza kupatikana kwa urahisi kupitia tovuti ya NCBI na hutumiwa katika programu nyingi za maisha halisi. Kwa mfano, FBI imeandaa seti za maeneo ya alama ya DNA kutumika kwa ajili ya kitambulisho, na hizi zinaitwa DNA database System (CODIS) DNA database. [35] Kutumia database hii inawezesha uchambuzi wa takwimu kutumiwa kuamua uwezekano kwamba sampuli ya DNA itafanana. PCR ni chombo chenye nguvu sana na kikubwa cha kuchunguza kwa kutumia DNA kuandika kwa sababu ya watafiti tu wanahitaji tu kiasi kidogo sana cha DNA lengo la kutumiwa kwa uchambuzi. Kwa mfano, nywele moja ya kibinadamu yenye follicle ya nywele iliyounganishwa ina DNA ya kutosha ili kufanya uchambuzi. Vile vile, manii chache, ngozi za ngozi kutoka chini ya vidole, au kiasi kidogo cha damu inaweza kutoa DNA ya kutosha kwa uchambuzi kamili. [35]
  • Aina ndogo ya ubaguzi wa kidole cha DNA inaweza kusaidia katika upimaji wa uzazi wa DNA , ambapo mtu anafanana na jamaa zao wa karibu. DNA kutoka kwa mabaki ya kibinadamu ambayo haijulikani yanaweza kupimwa, na ikilinganishwa na hayo kutoka kwa wazazi iwezekanavyo, ndugu au watoto. Kupima sawa kunaweza kutumiwa kuthibitisha wazazi wa kibiolojia wa mtoto aliyepitishwa (au nyara). Halisi kibiolojia baba wa mtoto mchanga pia inaweza alithibitisha (au ilitawala nje).

Maombi ya utafiti

PCR imetumika kwa maeneo mengi ya utafiti katika genetics ya molekuli:

  • PCR inaruhusu uzalishaji wa haraka wa vipande vipande vya DNA, hata wakati sio zaidi ya mlolongo wa vidole viwili vinajulikana. Uwezo huu wa PCR huingiza mbinu nyingi, kama vile kuzalisha suluhisho za uchanganuzi kwa uharibifu wa Kusini au kaskazini . PCR hutoa mbinu hizi kwa kiasi kikubwa cha DNA safi, wakati mwingine kama strand moja, kuwezesha uchambuzi hata kutoka kiasi kidogo sana cha nyenzo za kuanzia.
  • Kazi ya udhibiti wa DNA pia inaweza kusaidiwa na PCR. Makundi yanajulikana ya DNA yanaweza kutolewa kwa urahisi kutoka kwa mgonjwa mwenye mabadiliko ya ugonjwa wa maumbile. Marekebisho kwa mbinu ya kuongeza huweza kutokeza makundi kutoka kwa genome isiyojulikana kabisa, au inaweza kuzalisha moja tu ya eneo la riba.
  • PCR ina maombi mengi kwa mchakato wa jadi zaidi wa cloning ya DNA . Inaweza kuchimba makundi ya kuingizwa kwenye vector kutoka kwa jenome kubwa, ambayo inaweza kupatikana tu kwa kiasi kidogo. Kutumia seti moja ya 'vector primers', inaweza pia kuchambua au kuchunguza vipande ambavyo tayari vimeingizwa katika vectors. Mabadiliko mengine kwenye itifaki ya PCR yanaweza kuzalisha mabadiliko (jumla au tovuti iliyoongozwa) ya kipande kilichoingizwa.
  • Mipangilio ya mfululizo ya utaratibu ni mchakato ambapo PCR hutumiwa kama kiashiria kwamba sehemu fulani ya jenome iko kwenye kikundi fulani. Mradi wa Binadamu wa Genome uligundua kuwa programu hii ni muhimu kwa kupiga picha za clones za cosmid ambazo zilikuwa zimehifadhiwa, na kuratibu matokeo kutoka kwa maabara tofauti.
  • Matumizi ya kusisimua ya PCR ni uchambuzi wa phylogenic wa DNA kutoka vyanzo vya kale , kama vile vilivyopatikana katika mifupa yaliyopatikana ya Neanderthals , au kutoka kwa tishu zilizohifadhiwa za mammoth . Wakati mwingine DNA iliyoharibika sana kutoka kwa vyanzo hivi inaweza kuunganishwa wakati wa hatua za mwanzo za amplification.
  • Matumizi ya kawaida ya PCR ni utafiti wa ruwaza za kujieleza . Tishu (au hata seli za kila mtu) zinaweza kuchambuliwa kwa hatua tofauti ili kuona ni jeni gani ambalo limekuwa likifanya kazi, au limezimwa. Programu hii inaweza pia kutumia PCR ya kiasi cha kupima viwango halisi vya kujieleza
  • Uwezo wa PCR kuimarisha loci kadhaa kutoka kwa manii ya mtu binafsi [36] imeimarisha sana kazi ya jadi zaidi ya ramani ya maumbile kwa kujifunza chromosomal crossovers baada ya meiosis . Matukio ya mara kwa mara kati ya loci karibu sana yameonekana moja kwa moja kwa kuchunguza maelfu ya mbegu za kibinafsi. Vile vile, kufutwa kwa kawaida, kuingizwa, uhamisho, au inversions zinaweza kuchambuliwa, wote bila kusubiri (au kulipa) mchakato wa muda mrefu na ufanisi wa mbolea, embryogenesis, nk.

Ufafanuzi

PCR ina faida kadhaa. Ni rahisi kuelewa na kutumia, na hutoa matokeo haraka. Mbinu hii ni nyeti sana na uwezo wa kuzalisha mamilioni kwa mabilioni ya nakala ya bidhaa maalum kwa ajili ya ufuatiliaji, cloning, na uchambuzi. QRT-PCR inashiriki faida sawa na PCR, na faida ya ziada ya upimaji wa bidhaa yaliyotengenezwa. Kwa hivyo, ina matumizi yake kuchambua mabadiliko ya viwango vya kujieleza kwa jeni kwenye tumor, microbes, au nchi nyingine za magonjwa. [37]

Vikwazo

Kikwazo kimoja cha PCR ni kwamba taarifa za awali kuhusu mlolongo wa lengo ni muhimu ili kuzalisha vipaji ambavyo vitaruhusu kupanua upungufu wake. [38] Hii ina maana kwamba, kwa kawaida, watumiaji wa PCR wanapaswa kujua mlolongo sahihi juu ya kanda lengo katika kila moja ya templates single-stranded ili kuhakikisha kwamba DNA polymerase imefungwa vizuri kwa primer-template hybrids na hatimaye huzalisha kanda nzima lengo wakati wa awali ya DNA.

Kama vile enzymes zote, DNA polymerases pia husababishwa na kosa, ambayo kwa hiyo husababisha mabadiliko katika vipande vya PCR vinavyozalishwa. [39]

Tofauti

  • PCR kabisa : uchunguzi au cloning mbinu kulingana na tofauti nucleotide tofauti (SNVs si kuchanganyikiwa na SNPs ) (tofauti single-msingi katika mgonjwa). Inahitaji ujuzi wa awali wa mlolongo wa DNA, ikiwa ni pamoja na tofauti kati ya alleles , na hutumia primers ambao 3 'huisha kuingilia SNV (msingi wa buffer karibu SNV kawaida kuingizwa). Ukimishaji wa PCR chini ya masharti magumu ni ufanisi mdogo kwa uwepo wa kutofautiana kati ya template na primer, hivyo kupanua amplification na SNP-maalum signal primer ishara ya SNP maalum katika mlolongo. [40] Angalia SNP genotyping kwa maelezo zaidi.
  • Mkutano wa PCR au Bunge la Baiskeli la Polymerase (PCA) : awali ya bandia ya utaratibu wa DNA ndefu kwa kufanya PCR kwenye bwawa la oligonucleotides ndefu na makundi mafupi yanayoingiliana. Oligonucleotides hubadilishana kati ya maelekezo ya akili na antisense, na makundi yanayozunguka huamua utaratibu wa vipande vya PCR, na hivyo huchagua kuzalisha bidhaa za mwisho za DNA. [41]
  • PCR isiyo na kipimo : upendeleo huongeza nguvu moja ya DNA katika template ya DNA iliyopigwa mara mbili. Inatumika katika ufuatiliaji na ufuatiliaji uchunguzi ambapo upanuzi wa moja tu ya vipande viwili vya ziada vinahitajika. PCR hufanyika kama kawaida, lakini kwa ziada kubwa ya primer kwa strand walengwa kwa amplification. Kwa sababu ya kupungua kwa kasi ( hesabu ) baadaye katika mmenyuko baada ya primer limitation imekuwa kutumika juu, mzunguko ziada ya PCR inahitajika. [42] Mabadiliko ya hivi karibuni juu ya mchakato huu, inayojulikana kama L yasiyo - Fter- T he- E xponential-PCR (LATE-PCR), hutumia joto la kiwango kikubwa cha joto la kiwango ( Tm ) kuliko ya primer ili kudumisha mmenyuko ufanisi kama ukolezi wa kiwango cha primer hupungua katikati ya majibu. [43]
  • PCR convective : njia ya pseudo-isothermal ya kufanya PCR. Badala ya kurudia na kupumua mchanganyiko wa PCR, suluhisho linatokana na mafuta ya joto. Ukosefu wa utulivu wa mafuta unaotokana na mtiririko wa maambukizi kwa moja kwa moja hutenganisha reagents za PCR kutoka mikoa ya moto na baridi kwa kurudia kuwezesha PCR. [44] Parameters kama hali ya mipaka ya joto na jiometri ya enclosure ya PCR inaweza kuboreshwa ili kutoa PCR imara na ya haraka kwa kuimarisha kuongezeka kwa maeneo ya mtiririko wa machafuko. [45] Mtiririko kama huo wa PCR kuanzisha unapunguza kwa kiasi kikubwa mahitaji ya nguvu ya kifaa na wakati wa uendeshaji.
  • PCR ya kupiga simu: njia iliyo sawa sana ya kupata molekuli sahihi za DNA kwa awali ya jeni. Maktaba yenye ngumu ya molekuli za DNA inabadilishwa na vitambulisho vya kipekee vya kupiga picha kabla ya uingiliano massively sambamba. Vipande vinavyoongozwa na lebo basi huwezesha kurejesha kwa molekuli na utaratibu unaotaka na PCR. [46]
  • Digital PCR (dPCR) : kutumika kuchunguza wingi wa mlolongo wa DNA lengo katika sampuli ya DNA. Sampuli ya DNA imezidishwa sana ili baada ya kuendesha PCR nyingi sambamba, baadhi yao hawapati molekuli moja ya DNA ya lengo. Mkusanyiko wa DNA lengo ni mahesabu kwa kutumia idadi ya matokeo hasi. Hivyo jina 'digital PCR'.
  • Amplification ya kutegemea helicase : sawa na PCR ya jadi, lakini hutumia joto la kawaida badala ya baiskeli kwa njia ya dalili na mizunguko ya annealing / ugani. Helifikia ya DNA , enzyme ambayo hutenganisha DNA, hutumiwa badala ya uharibifu wa mafuta. [47]
  • Moto kuanza PCR : mbinu ambayo inapunguza upungufu usio maalum wakati wa kuweka hatua za awali za PCR. Inaweza kufanywa kwa manually kwa kuchomwa vipengele vya majibu kwa joto la denaturation (kwa mfano, 95 ° C) kabla ya kuongeza polymerase. [48] Mifumo ya enzyme maalum imekuwa imetengenezwa ili kuzuia shughuli ya polymerase kwa joto la chini, ama kwa kumfunga ya antibody [14] [49] au kwa kuwepo kwa inhibitors zilizoingizwa kwa uingilivu ambazo zinajitokeza tu baada ya hatua ya uanzishaji wa joto. PCR ya kuanza-baridi / baridi hupatikana kwa polymerases mpya ya mseto ambayo haitumiki katika hali ya joto ya joto na huwashwa wakati wa joto la joto.
  • Katika PCR ya silico ( PCR ya digital, PCR virtual, PCR ya umeme, e-PCR) inahusu vifaa vya computational kutumika kwa mahesabu matokeo ya majibu ya mnyororo wa polymerase kwa kutumia seti iliyotolewa ya vitambaa ( probes ) ili kuimarisha utaratibu wa DNA kutoka genome au transcriptome . Katika PCR ya silico ilipendekezwa kama chombo cha elimu kwa biolojia ya molekuli. [50]
  • PCR maalum (ISSR): njia ya PCR ya kidole cha DNA ambacho huongeza mikoa kati ya kurudia mlolongo rahisi ili kuzalisha vidole vya kipekee vya urefu wa fragment. [51]
  • PCR inverse : hutumika kwa kawaida kutambua utaratibu wa flanking karibu na uingizaji wa genomic . Inahusisha mfululizo wa digesheni za DNA na mzunguko wa kibinafsi , na kusababisha utaratibu unaojulikana mwishoni mwa mlolongo usiojulikana. [52]
  • PCR iliyopatanishwa na Ligation : hutumia viungo vidogo vya DNA vinavyotokana na DNA ya maslahi na vipaji vingi vinavyounganisha na viungo vya DNA; imetumika kwa ufuatiliaji wa DNA , kutembea kwa genome , na DNA footprinting . [53]
  • PCR (MSP) maalum ya methylation: iliyoandaliwa na Stephen Baylin na Jim Herman katika Shule ya Matibabu ya Johns Hopkins, [54] na hutumiwa kuchunguza methylation ya visiwa vya CpG katika DNA ya genomic. DNA inatibiwa mara ya kwanza na bisulfite ya sodiamu, ambayo inabadilika msingi wa cytosine usio na kipimo, ambayo hutambuliwa na primers za PCR kama thymine. Kwa hiyo PCR mbili zinafanyika kwenye DNA iliyobadilishwa, kutumia primer kuweka sawa kufanana na yoyote visiwa CpG ndani ya utaratibu wa kwanza. Katika vitu hivi, moja ya vitambaa hutambua DNA na cytosines ili kuongeza DNA ya methyloni, na kuweka moja inatambua DNA kwa uracil au thymine ili kuongeza DNA unmethylated. MSP kutumia qPCR pia inaweza kufanywa ili kupata taarifa ya kiasi kuliko ubora kuhusu methylation.
  • PCR Miniprimer : hutumia polymerase inayoweza kutengeneza (S-Tbr) ambayo inaweza kupanua kutoka kwenye vipindi vifupi ("smalligos") kama mfupi kama nucleotidi 9 au 10. Njia hii inaruhusu PCR kuzingatia mikoa ndogo ya kumalizia primer, na hutumiwa kuimarisha utaratibu wa DNA uliohifadhiwa, kama vile jeni ya rRNA ya 16S (au eukaryotic 18S). [55]
  • Kupanua kwa mzunguko wa Multiplex-dependent probe ( MLPA ): vibali huongeza malengo mengi na jozi moja ya primer, hivyo kuepuka mapungufu ya azimio ya PCR multiplex (angalia chini).
  • Multiplex-PCR : ina seti nyingi za primer ndani ya mchanganyiko mmoja wa PCR ili kutoa amplicons ya ukubwa tofauti ambayo ni maalum kwa utaratibu tofauti wa DNA. Kwa kulenga jeni nyingi kwa mara moja, maelezo ya ziada yanaweza kupatikana kutoka kwa mtihani mmoja-kukimbia ambao vinginevyo unahitaji mara kadhaa reagents na muda zaidi kufanya. Joto la Annealing kwa kila seti za kwanza hupaswa kuwezeshwa kufanya kazi kwa usahihi ndani ya mmenyuko mmoja, na ukubwa wa amplicon. Hiyo ni, urefu wao wa jozi ya msingi lazima iwe tofauti kutosha ili kuunda bendi tofauti wakati umeonyeshwa na electrophoresis ya gel .
  • Nanoparticle-Msaidizi wa PCR (nanoPCR) : Katika miaka ya hivi karibuni, imearipotiwa kuwa baadhi ya nanoparticles (NPs) zinaweza kuongeza ufanisi wa PCR (kwa hiyo inaitwa nanoPCR), na baadhi hata hufanya vizuri zaidi kuliko waimarishaji wa PCR wa awali. Pia iligundua kwamba dhahabu za quantum (QDs) zinaweza kuboresha ufanisi wa PCR na ufanisi. Vipimo vya kaboni za nanotubesi (single-walled carbon nanotubes) (SWCNTs) na multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) zina ufanisi katika kuboresha amplification ya PCR ndefu. Carbon nanopowder (CNP) iliripotiwa kuwa na uwezo wa kuboresha ufanisi wa PCR mara kwa mara na PCR ndefu. ZnO, TiO 2 , na NPs za Ag pia zilipatikana ili kuongeza mazao ya PCR. Muhimu, data tayari inayojulikana imeonyesha kuwa NP zisizo za metali zimekubalika kukubalika kwa uaminifu. Kutokana na kwamba wengi wa NPs wana uwezo wa kuimarisha ufanisi wa PCR, ni wazi kuwa kuna uwezekano mkubwa wa kuboresha teknolojia ya nanoPCR na maendeleo ya bidhaa. [56] [57]
  • PCR iliyojaa : huongeza upeo wa amplification ya DNA, kwa kupunguza background kutokana na amplification yasiyo ya maalum ya DNA. Seti mbili za primers hutumiwa katika PCR mbili za mfululizo. Katika mmenyuko ya kwanza, jozi moja ya vitambaa hutumiwa kuzalisha bidhaa za DNA, ambazo badala ya malengo yaliyokusudiwa, bado zinaweza kuwa na vipande vya DNA ambazo hazijapanuliwa. Bidhaa hiyo hutumiwa katika PCR ya pili na seti ya vipaji ambazo maeneo ya kumfunga ni tofauti kabisa au tofauti na ya 3 'ya kila moja ya vitendo vilivyotumiwa katika majibu ya kwanza. PCR iliyojaa mara nyingi inafanikiwa zaidi katika kuimarisha vipande vya DNA ndefu kuliko PCR ya kawaida, lakini inahitaji ujuzi wa kina zaidi wa utaratibu wa lengo.
  • Kuingiliana-upanuzi wa PCR au kupanua kwa kuongezeka kwa ugani (SOEing) : mbinu ya uhandisi wa maumbile ambayo hutumiwa kuunganisha vipande viwili au zaidi vya DNA ambavyo vina vifunguzo vya ziada. Inatumika kujiunga na vipande vya DNA vyenye jeni, utaratibu wa udhibiti, au mabadiliko; mbinu inawezesha uumbaji wa DNA maalum na ya muda mrefu. Inaweza pia kuanzisha deletions, insertions au mabadiliko ya uhakika katika mlolongo wa DNA. [58] [59]
  • PAN-AC : hutumia hali ya isothermal ya amplification, na inaweza kutumika katika seli zilizo hai. [60] [61]
  • PCR ya kiasi (qPCR): kutumika kupima wingi wa mlolongo wa lengo (kwa kawaida katika muda halisi). Inapunguza kiasi cha kuanzia kiasi cha DNA, cDNA, au RNA. PCR ya kawaida hutumiwa kwa kawaida kama mlolongo wa DNA ulipo katika sampuli na idadi ya nakala zake katika sampuli. PCR yenye thamani ina kiwango cha juu sana cha usahihi. Upimaji mbinu PCR kutumia dyes umeme, kama vile Sybr Green, EvaGreen au fluorophore -containing DNA probes, kama vile TaqMan , kupima kiasi cha bidhaa kukuzwa katika muda halisi. Pia wakati mwingine hufupishwa kwa RT-PCR ( halisi ya muda wa PCR) lakini kifungu hiki kinatakiwa kutumika tu kwa PCR ya kubadilisha upya . qPCR ni contractions sahihi kwa PCR kiasi (halisi wakati PCR).
  • Reverse Transcription PCR ( RT-PCR ) : kwa kukuza DNA kutoka RNA. Reverse transcriptase inverse inatafsiri RNA ndani ya cDNA , ambayo inasisitizwa na PCR. RT-PCR hutumiwa sana katika maelezo ya kujieleza , kuamua kujieleza kwa jeni au kutambua mlolongo wa nakala ya RNA, ikiwa ni pamoja na kuanza kwa usajili na maeneo ya kukomesha. Ikiwa jenereta ya DNA ya genomic ya jeni inajulikana, RT-PCR inaweza kutumika kwa ramani ya eneo la exons na introns katika jeni. Mwisho wa 5 wa jeni (sambamba na tovuti ya kuanza kwa usajili) ni kawaida kutambuliwa na RACE-PCR ( Mwisho Amplification ya CDNA Mwisho ).
  • RNase H-tegemezi PCR (rhPCR): urekebishaji wa PCR ambayo hutumia primers kwa kuzuia ugani wa 3 ambao unaweza kuondolewa kwa enzyme ya RNase HII inayoweza kutumiwa. Mfumo huu hupunguza primer-dimers na inaruhusu athari nyingi zinazopaswa kufanyika na idadi kubwa ya vipaji. [62]
  • Sura ya kwanza ya Primer-PCR (SSP-PCR): inaruhusu kuimarishwa kwa DNA mbili iliyopigwa hata wakati maelezo ya mlolongo inapatikana kwa mwisho mmoja tu. Njia hii inaruhusu kuimarisha jeni ambazo habari tu ya mlolongo hupatikana, na inaruhusu genome unidirectional kutembea kutoka inayojulikana katika mikoa haijulikani ya chromosome. [63]
  • PCR ya Awamu ya Kudumu : inajumuisha maana nyingi, ikiwa ni pamoja na Amplification ya Poloni (kwa mfano, ambapo makoloni ya PCR hutolewa katika tumbo la gel), Bridge PCR [64] (vipaji vinaunganishwa kwa uingiliano na uso wa imara), kawaida PCR ya Awamu ya Soli (ambapo PCR isiyo na kipimo hutumiwa mbele ya mshikamano wa kuzaa imara na mlolongo unaohusiana na moja ya vipindi vya maji yenye maji) na PCR ya Awamu ya Kuimarisha [65] (ambapo kawaida PCR ya Awamu ya Soli inaweza kuboreshwa kwa kutumia high Tm na msingi wa msaada wa imara na maombi ya hiari ya 'hatua' ya mafuta ili kupendeza msaada wa kudumu kwa msaada).
  • Kujiua PCR : kawaida kutumika katika paleogenetics au masomo mengine ambapo kuepuka chanya za uongo na kuhakikisha maalum ya kipande kilichopanuliwa ni kipaumbele cha juu zaidi. Ilifafanuliwa awali katika uchunguzi ili kuthibitisha kuwepo kwa microbe Yersinia pestis katika sampuli za meno zilizopatikana kutoka makaburi ya karne ya 14 ya watu wanaodhaniwa waliuawa na pigo wakati wa janga la kati la Kifo cha Black . [66] Njia hii inaelezea matumizi ya mchanganyiko wowote wa primer mara moja katika PCR (hivyo neno "kujiua"), ambalo halipaswi kutumiwa katika mmenyuko wowote wa kudhibiti PCR, na vipaji lazima daima kulenga kanda za genomic ambazo hazipatikani kabla ya maabara kutumia hii au seti nyingine yoyote ya primers. Hii inahakikisha kuwa hakuna DNA inayojitenga na athari za PCR zilizopita ziko kwenye maabara, ambayo inaweza vinginevyo kuzalisha chanya cha uongo.
  • PCR iliyosababishwa na joto isiyo ya kawaida ( TAIL-PCR ) : kwa kutengwa kwa mlolongo usiojulikana unaozunguka mlolongo unaojulikana. Katika mlolongo unaojulikana, TAIL-PCR hutumia jozi lenye mazao ya joto na joto tofauti; primer ya kuzorota hutumiwa kupanua katika mwelekeo mwingine kutoka kwa mlolongo usiojulikana. [67]
  • PCR Touchdown ( PCR -Hatua ya chini ): tofauti ya PCR ambayo ina lengo la kupunguza background isiyo ya kawaida kwa kupunguza hatua kwa hatua kupunguza joto la anneal kama baiskeli ya PCR inavyoendelea. Joto la annealing katika mzunguko wa awali ni kawaida ya digrii chache (3-5 ° C) juu ya T m ya vitambaa vilivyotumiwa, wakati kwenye mzunguko wa baadaye, ni daraja chache (3-5 ° C) chini ya T m . Joto la juu hutoa maalum zaidi kwa ajili ya kumfunga kwanza, na joto la chini linaruhusu amplification bora zaidi kutoka kwa bidhaa maalum zilizoundwa wakati wa mzunguko wa awali. [68]
  • Universal Walking : kwa kutembea kwa genome na vidole vya kidole vyenye kutumia kidole kwa kutumia "PC-mbili" za kawaida zaidi kuliko mbinu za kawaida za 'upande mmoja' (kutumia moja tu ya jeni maalum na ya kwanza ya primer-ambayo inaweza kusababisha 'artefactual' kelele) [69] kwa njia ya utaratibu unaohusisha muundo wa lariat malezi. Dalili zilizopangwa kwa UFW ni LaNe RAGE (PCR iliyojaa lariat-inategemea kwa kuongeza kasi ya DNA ya genomic), [70] 5'RACE LaNe [71] na 3'RACE LaNe. [72]

Historia

Uwakilishi wa mchoro wa jozi la kwanza la kwanza. Matumizi ya vipaji katika kipimo cha vitro kuruhusu awali DNA ilikuwa innovation kuu ambayo kuruhusu maendeleo ya PCR.

Karatasi ya 1971 katika jarida la Journal of Molecular Biology na Kjell Kleppe ( hapana ) na wafanyakazi wa ushirikiano katika maabara ya H. Gobind Khorana kwanza alielezea njia kwa kutumia jaribio la enzymatic kuiga template ya DNA fupi na vitamini katika vitro . [73] Hata hivyo, udhihirisho huu wa kwanza wa kanuni ya msingi ya PCR haukupokea kipaumbele kwa wakati huo, na uvumbuzi wa mmenyuko wa mnyororo wa polymerase mwaka 1983 kwa ujumla ni sifa kwa Kary Mullis . [74]

"Baby Blue", mfano 1986 mfano wa kufanya PCR

Wakati Mullis alipouza PCR mwaka 1983, alikuwa akifanya kazi huko Emeryville , California kwa Cetus Corporation , mojawapo ya makampuni ya kwanza ya kibayoteknolojia . Huko, alikuwa na jukumu la kuunganisha minyororo machache ya DNA. Mullis ameandika kwamba alikuwa mjamzito wa PCR wakati akipitia kando ya Pacific Coast Highway usiku mmoja katika gari lake. [75] Alikuwa kucheza katika akili yake na njia mpya ya kuchambua mabadiliko (mabadiliko) katika DNA alipogundua kuwa alikuwa badala zuliwa njia ya amplifying eneo lolote DNA kwa njia ya mzunguko wa mara kwa mara ya marudio inayotokana na DNA polima. Katika Scientific American , Mullis alitoa muhtasari wa utaratibu: "Kuanzia na molekuli moja ya DNA ya maumbile, PCR inaweza kuzalisha molekuli sawa sawa na mia moja bilioni mchana.Kujibu ni rahisi kutekeleza.Inahitaji zaidi kuliko tube ya mtihani, reagents chache rahisi, na chanzo cha joto. " [76] Mwaka wa 1988, DNA ya kwanza ya alama za kidole hutumika kwa ajili ya upimaji wa uzazi mwaka 1988. [77]

Mullis alipewa tuzo ya Nobel katika Kemia mwaka 1993 kwa ajili ya uvumbuzi wake, [7] miaka saba baada ya yeye na wenzake huko Cetus kwanza kuweka pendekezo lake la kufanya mazoezi. Hata hivyo, utata fulani umebaki juu ya michango ya kitaaluma na ya vitendo ya wanasayansi wengine kwa kazi ya Mullis, na kama alikuwa ndiye mwanzilishi wa pekee wa kanuni ya PCR (tazama hapa chini).

Katika msingi wa njia PCR ni matumizi ya kufaa DNA polima na uwezo wa kuhimili joto ya juu ya> 90 ° C (194 ° F) inahitajika kwa ajili ya mgawanyo wa ncha mbili DNA katika DNA mbili helix baada ya kila kuiga mzunguko. DNA polymerases awali walioajiriwa kwa vitro majaribio ya kuokoa PCR hawakuweza kukabiliana na joto hizi. [4] Hivyo taratibu za mwanzo za replication ya DNA zilikuwa hazifanyi vizuri na zinahitajika muda mrefu, na zinahitajika kiasi kikubwa cha DNA polymerase na utunzaji wa kuendelea katika mchakato huo.

Ugunduzi wa mwaka wa 1976 wa Taq polymerase - DNA polymerase iliyojitakasa kutokana na bakteria ya thermophilic , Thermus aquaticus , ambayo kwa kawaida inaishi katika moto (50 hadi 80 ° C (122-1176 ° F)) mazingira [15] kama chemchemi za moto - zimefunikwa njia ya uboreshaji mzuri wa njia ya PCR. DNA polymerase pekee kutoka T. aquaticus imara katika joto la juu inabakia kazi hata baada ya dataturation ya DNA, [16] hivyo kuzuia haja ya kuongeza DNA polymerase mpya baada ya kila mzunguko. [5] Hii iliruhusu mchakato wa msingi wa thermocycler-msingi wa amplification ya DNA.

Migogoro ya Patent

Mbinu ya PCR ilikuwa hati miliki na Kary Mullis na kupewa eneo la Cetus Corporation , ambako Mullis alifanya kazi wakati alipoumba mbinu mwaka wa 1983. Enzyme ya Taq polymerase pia ilifunikwa na ruhusa. Kumekuwa na mashtaka kadhaa ya juu ya wasiwasi kuhusiana na mbinu, ikiwa ni pamoja na kesi isiyofanikiwa iliyoletwa na DuPont . Kampuni ya dawa Hoffmann-La Roche ilinunua haki za hati miliki mwaka 1992 na kwa sasa inashikilia yale ambayo bado yanalindwa.

Vita vinavyohusiana na patent juu ya enzyme Taq polymerase bado vinaendelea katika mamlaka kadhaa duniani kote kati ya Roche na Promega . Mahakamani ya kisheria yameongezwa zaidi ya maisha ya ruhusa ya awali ya PCR na Taq polymerase, ambayo ilifariki tarehe 28 Machi 2005. [78]

Tazama pia

  • Kuimarishwa kwa isothermal kwa kupikwa kwa kitanzi
  • DNA ya kupiga

Marejeleo

  1. ^ B "PCR" . Kituo cha Mafunzo ya Sayansi ya Sayansi, Chuo Kikuu cha Utah .
  2. ^ Bartlett, JMS; Kugusa, D. (2003). "Historia fupi ya Reaction Polymerase Chain Reaction". Programu za PCR . Mbinu katika Biolojia ya Masi. 226 (2nd ed.). pp. 3-6. Nini : 10.1385 / 1-59259-384-4: 3 . ISBN 1-59259-384-4 .
  3. ^ Mullis, Kary B. et al. "Mchakato wa kupanua, kuchunguza, na / au-cloning utaratibu wa asidi ya nyuklia" Patent ya Marekani 4,683,195
  4. ^ B c Saiki, R .; Scharf, S .; Faloona, F .; Mullis, K .; Pembe, G .; Erlich, H .; Arnheim, N. (1985). "Kupanua kwa enzymatic ya utaratibu wa beta-globin genomic na uchambuzi wa kizuizi wa tovuti kwa ajili ya uchunguzi wa anemia ya sindano ya sindano". Sayansi . 230 (4732): 1350-1354. Nini : 10.1126 / sayansi.2999980 . PMID 2999980 .
  5. ^ B Saiki, R .; Gelfand, D .; Stoffel, S .; Scharf, S .; Higuchi, R .; Pembe, G .; Mullis, K .; Erlich, H. (1988). "Kupanua kwa nguvu ya enzymatic ya DNA kwa DNA polymerase". Sayansi . 239 (4839): 487-491. Je : 10.1126 / sayansi.2448875 . PMID 2448875 .
  6. ^ J., Ninfa, Alexander; P., Ballou, Daudi (2004). Mbinu kuu za maabara ya biochemistry na bioteknolojia . Wiley. ISBN 1891786008 . OCLC 633862582 .
  7. ^ B "Kary B. Mullis - Tuzo ya Hotuba: polimerasi" .
  8. ^ Cheng, S .; Mchezaji, C .; Barnes, WM; Higuchi, R. (1994). "Amplification ya Ufanisi wa Malengo Mrefu kutoka kwa Kuingiza Cloned na DNA ya Binadamu ya Genomic" . Mahakama ya Chuo cha Taifa cha Sayansi . 91 (12): 5695-5699. doi : 10.1073 / pnas.91.12.5695 . PMC 44063 Freely accessible . PMID 8202550 .
  9. ^ Carr AC, Moore SD (2012). Lucia, Alejandro, ed. "Uthibitishaji mkubwa wa athari za mnyororo wa polymerase ukitumia kufaa kimataifa" . PLoS ONE . 7 (5): e37640. Je : 10.1371 / jarida.pone.0037640 . PMC 3365123 Freely accessible . PMID 22701526 .
  10. ^ B Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). Cloning ya Masi: Mwongozo wa Maabara (3rd ed.). Hifadhi ya Cold Spring, NY: Waandishi wa Habari za Maabara ya Cold Spring Harbor. ISBN 0-879-69576-5 . Sura ya 8: In vitro Amplification ya DNA na Reaction Polymerase Chain Reaction
  11. ^ "Polymerase Chain Reaction (PCR)" . Kituo cha Taifa cha Habari za Biotechnology, Maktaba ya Taifa ya Madawa ya Marekani.
  12. ^ Pavlov, AR; Pavlova, NV; Kozyavkin, SA; Slesarev, AI (2004). "Maendeleo ya hivi karibuni katika uboreshaji wa DNA polymerases zinazoweza kutumiwa kwa ajili ya maombi ya ufanisi ☆". Mwelekeo katika Biotechnology . 22 (5): 253-260. Je : 10.1016 / j.tibtech.2004.02.011 . PMID 15109812 .
  13. ^ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Uboreshaji wa joto la annealing kwa amplification ya DNA katika vitro" . Nucleic Acids Res . 18 (21): 6409-6412. toleo : 10.1093 / nar / 18.21.6409 . PMC 332522 Freely accessible . PMID 2243783 .
  14. ^ B Sharkey, DJ, Scalice, ER; Christy, KG; Atwood, SM; Daiss, JL (1994). "Antibodies kama Switch Thermolabile: High Temperature kuchochea kwa Polymerase Chain Reaction". Bio / Teknolojia . 12 (5): 506-509. Je : 10.1038 / nbt0594-506 .
  15. ^ B Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase kutoka thermophile kali Thermus aquaticus" . J. Bacteriol . 127 (3): 1550-1557. PMC 232952 Freely accessible . PMID 8432 .
  16. ^ B Mwanasheria, F .; Stoffel, S .; Saiki, R .; Chang, S .; Ardhi, P .; Abramson, R .; Gelfand, D. (1993). "Ufafanuzi wa kiwango cha juu, utakaso, na utambulisho wa enzymatic wa muda mrefu wa Thermus aquaticus DNA polymerase na fomu ya truncated haitoshi katika shughuli ya 5 'hadi 3' ya exonuclease". Mbinu za PCR na programu . 2 (4): 275-287. doi : 10.1101 / gr.2.4.275 . PMID 8324500 .
  17. ^ Campbell Biolojia, toleo la 7
  18. ^ Borman, Jon; Mtaa, Daudi; Li, Wu-bo; Jesse, Joel na Rashtchian, Ayoub (2000). "PCR kutoka templates tatizo" (PDF) . Mtazamo . 22 (1): 10.
  19. ^ Bogetto, Prachi na Waidne, Lisa (2000). "Vidokezo vya manufaa kwa PCR" (PDF) . Mtazamo . 22 (1): 12.
  20. ^ Sarkar, G .; Kapelner, S .; Sommer, S. (1990). "Formamide inaweza kuboresha kwa kiasi kikubwa ufanisi wa PCR" . Utafiti wa Nucleic Acids . 18 (24): 7465. hati : 10.1093 / nar / 18.24.7465 . PMC 332902 Freely accessible . PMID 2259646 .
  21. ^ "PCR ya umeme" . NCBI - Kituo cha Taifa cha Habari za Bioteknolojia . Iliondolewa Machi 13, 2012 .
  22. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). "DNA polymerases zinazoweza kutumiwa kwa ajili ya Wide Wide wa Maombi: Kulinganisha TopoTaq ya Mchanganyiko Mzuri kwa Enzymes nyingine". Katika Kieleczawa J. DNA Ufuatiliaji II: Kuboresha Maandalizi na Usafishaji . Jones na Bartlett. pp. 241-257. ISBN 0-7637-3383-0 .
  23. ^ Pombert JF, Sistek V, Boissinot M, Frenette M (2009). "Mahusiano ya mageuzi kati ya salivarius streptococci kama yaliyotokana na multilocus phylogenies kulingana na 16S rRNA-encoding, recA, secA, na sequences gene sekunde" . BMC Microbiol . 9 : 232. dini : 10.1186 / 1471-2180-9-232 . PMC 2777182 Freely accessible . PMID 19878555 .
  24. ^ "Utaratibu wa Kemikali, Utaratibu, na Kupitishwa kwa DNA (maelezo ya darasa kwenye MBB / BIO 343)" . Chuo Kikuu cha Arizona State. Imehifadhiwa kutoka kwa asili ya 1997-10-09 . Ilifutwa 2007-10-29 .
  25. ^ Garibyan, Avashia (Machi 2013). "Polymerase Chain Reaction" . Journal of Dermatology Investigative . 133 : 1-4. Je : 10.1038 / jid.2013.1 . PMC 4102308 Freely accessible . PMID 23399825 .
  26. ^ P., Ballou, Daudi; Marilee., Benore, (2010). Mbinu kuu za maabara ya biochemistry na bioteknolojia . John Wiley. ISBN 9780470087664 . OCLC 420027217 .
  27. ^ Pertalia, Salvatore. "Teknolojia za PCR kwa ajili ya Uchunguzi wa Uhakika wa Huduma: Maendeleo na Mtazamo" . Machapisho ya ACS . American Chemical Society . Iliondolewa Novemba 20, 2017 .
  28. ^ Furahia E "Jumuiya ya Vidokezo Vya Damu" Magazine Magazine (14 Machi 2008) pp. 1478-1479.
  29. ^ Tomar, Rukam (2010). Marker Masi na Bioteknolojia ya Kupanda . Pitman Pura, New Delhi: Shirika la Kuchapisha New India. p. 188. ISBN 978-93-80235-25-7 .
  30. ^ Garibyan, Avashia (Machi 2013). "Polymerase Chain Reaction" . Journal of Dermatology Investigative . 133 : 1-4. Je : 10.1038 / jid.2013.1 . PMC 4102308 Freely accessible . PMID 23399825 . Angalia maadili ya tarehe katika: |date= ( msaada )
  31. ^ B c Cai, H, Caswell JL; Prescott JF (Machi 2014). "Utamaduni wa Mifugo Mbinu za Kutambua Ugonjwa wa Bakteria Kwa Wanyama: Mtazamo wa Maabara ya Kujua" . Mifugo ya Mifugo . 51 (2): 341-350. Je : 10.1177 / 0300985813511132 . PMID 24569613 .
  32. ^ Salis AD (2009). "Maombi katika Microbiolojia ya Kliniki". PCR ya Muda halisi: Teknolojia ya sasa na Maombi . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4 .
  33. ^ Kwok S et al. "Utambulisho wa utaratibu wa VVU kwa kutumia vidonge vya vitamini vyenye vitamini na uchunguzi wa ugonjwa wa oligomer." J. Virol. vol. 61 (5) uk. 1690-4 (1987).
  34. ^ Ninfa, Alexander; Ballou, David P .; Benore, Marilee (2009). Maabara ya Msingi ya Maabara ya Biolojia na Bioteknolojia . Marekani: Wiley. pp. 408-410. ISBN 9780470087664 .
  35. ^ B c Ninfa, Alexander, Ballou, Daudi; Benore, Marilee (2009). Maabara ya Msingi ya Maabara ya Biolojia na Bioteknolojia . Marekani: Wiley. pp. 408-410. ISBN 978-0470087664 .
  36. ^ Boehnke M et al. "Sahihi-muundo ramani ya maumbile ya chromosomes ya binadamu kutumia mmenyuko polymerase juu ya mbegu moja." Am J Hum Genet vol. 45 (1) uk. 21-32 (1989).
  37. ^ Garibyan, Lilit; Avashia, Nidhi (2013-03-01). "Polymerase Chain Reaction" . Journal of Dermatology Investigative . 133 (3): 1-4. Je : 10.1038 / jid.2013.1 . ISSN 0022-202X . PMC 4102308 Freely accessible . PMID 23399825 .
  38. ^ Garibyan L, Avashia N (2013). "Polymerase Chain Reaction" . Journal of Dermatology Investigative . 133 : 1-4. Je : 10.1038 / jid.2013.1 . PMC 4102308 Freely accessible . PMID 23399825 .
  39. ^ Zhou, YH; Zhang, XP; Ebright, RH (1991-11-11). "Mutagenesis ya kawaida ya molekuli za DNA za jeni kwa matumizi ya PCR na Taq DNA polymerase" . Utafiti wa Nucleic Acids . 19 (21): 6052. dini : 10.1093 / nar / 19.21.6052 . ISSN 0305-1048 . PMC 329070 Freely accessible . PMID 1658751 .
  40. ^ Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF (1989). "Uchambuzi wa mabadiliko yoyote ya DNA." Mfumo wa mabadiliko ya kinga ya amplification (ARMS) " . Utafiti wa Nucleic Acids . 17 (7): 2503-2516. Je : 10.1093 / nar / 17.7.2503 . PMC 317639 Freely accessible . PMID 2785681 .
  41. ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (1995). "Mkutano wa hatua moja ya gene na plasmid nzima kutoka kwa idadi kubwa ya oligodeoxyribonucleotides". Gene . 164 (1): 49-53. Nini : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00511-4 . PMID 7590320 .
  42. ^ Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA (1988). "DNA ya ugavi na Thermus aquaticus DNA polymerase na uwiano wa moja kwa moja ya polymerase mnyororo mmenyuko-amplified DNA" . Proc Natl Acad Sci USA . 85 (24): 9436-9440. doi : 10.1073 / pnas.85.24.9436 . PMC 282767 Freely accessible . PMID 3200828 .
  43. ^ Pierce KE & Wangh LJ (2007). "Teknolojia ya mchanganyiko wa polymerase ya mfululizo na baada ya ufanisi na teknolojia zinazohusiana. Mipango halisi ya kugundua wakati wa kugundua haraka na ya uhakika kutoka seli moja". Mbinu Mol Med . Mbinu katika Madawa ya Masi ™ ™. 132 : 65-85. Nini : 10.1007 / 978-1-59745-298-4_7 . ISBN 978-1-58829-578-1 . PMID 17876077 .
  44. ^ Krishnan, Madhavi; Sema, Victor; Burns, Mark (2002). "PCR katika kiini cha Rayleigh-Benard convection". Sayansi (298,5594): 793-793.
  45. ^ Kwanza , Aashishi; Hassan, Yassin; Ugaz, Victor (2013). "Microscale chaotic advection inawezesha kujitegemea DNA ya ufuatiliaji". Analytical Chemistry . 85 (21): 10536-10541. Je : 10.1021 / ac402611s .
  46. ^ Schwartz JJ, Lee C, Shendure J (2012). "Jeni sahihi ya awali na upatikanaji wa tag ulioongozwa na molekuli za DNA za kuthibitishwa kwa mlolongo" . Njia za Hali . 9 (9): 913-915. Je : 10.1038 / nmeth.2137 . PMC 3433648 Freely accessible . PMID 22886093 .
  47. ^ Vincent M, Xu Y, Kong H (2004). "Heligase-dependent DNA isothermal amplification" . Taarifa za EMBO . 5 (8): 795-800. Je : 10.1038 / sj.embor.7400200 . PMC 1249482 Freely accessible . PMID 15247927 .
  48. ^ Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (1992). "Kuzuia kupungua kwa kabla ya PCR mis-priming na primer dimerization inaboresha upungufu wa namba ya chini-nakala" . Utafiti wa Nucleic Acids . 20 (7): 1717-1723. Je : 10.1093 / nar / 20.7.1717 . PMC 312262 Freely accessible . PMID 1579465 .
  49. ^ Kellogg, DE; Rybalkin, mimi; Chen, S; Mukhamedova, N; Vlasik, T; Siebert, PD; Chenchik, A (1994). "TaqStart Antibody:" kuanza kwa moto "PCR iliyosaidiwa na kupambana na antibody ya monoclonal iliyosaidiwa dhidi ya Taq DNA polymerase". BioTechniques . 16 (6): 1134-7. PMID 8074881 .
  50. ^ San Millan RM, Martinez-Ballesteros Mimi, Rementeria A, Garaizar J, Bikandi J (2013). Zoezi la mtandaoni la kubuni na simulation ya majaribio ya PCR na PCR-RFLP " . Vidokezo vya Utafiti wa BMC . 6 : 513. dini : 10.1186 / 1756-0500-6-513 . PMC 4029544 Freely accessible . PMID 24314313 .
  51. ^ Zietkiewicz, E .; Rafalski, A .; Labuda, D. (1994). "Ujumbe wa kidole wa kidole kwa kurudia mlolongo rahisi (SSR) -washirikisha upungufu wa mmenyuko wa mnyororo wa polymerase". Genomics . 20 (2): 176-83. doi : 10.1006 / geno.1994.1151 . PMID 8020964 .
  52. ^ Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988). "Maombi ya Maumbile ya Mfumo wa Kipengee cha Polymerase" . Genetics . 120 (3): 621-623. PMC 1203539 Freely accessible . PMID 2852134 .
  53. ^ Mueller PR, Wold B (1988). " Katika vivo footprinting ya misuli maalum enhancer na ligation mediated PCR". Sayansi . 246 (4931): 780-786. Je : 10.1126 / sayansi.2814500 . PMID 2814500 .
  54. ^ Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996). "PCR maalum ya methylation: Ratiba ya PCR riwaya kwa hali ya methylation ya visiwa vya CpG" . Proc Natl Acad Sci USA . 93 (13): 9821-9826. doi : 10.1073 / pnas.93.18.9821 . PMC 38513 Freely accessible . PMID 8790415 .
  55. ^ Isenbarger TA, Finney M, Ríos-Velázquez C, Handelsman J, Ruvkun G (2008). "PCR Miniprimer, Lens Mpya kwa Kuangalia Dunia Microbial" . Microbiolojia ya Maombi na Mazingira . 74 (3): 840-9. doi : 10.1128 / AEM.01933-07 . PMC 2227730 Freely accessible . PMID 18083877 .
  56. ^ Cenchao Shen; Yang Wenjuan; Qiaoli Ji; Hisaji Maki; Anjie Dong; Zhizhou Zhang (2009). Uchunguzi wa NanoPCR: viwango tofauti vya uaminifu wa DNA katika ufanisi wa mnyororo wa polymerase ya nanoparticle ". Nanoteknolojia . 20 : 455103. dini : 10.1088 / 0957-4484 / 20/45/455103 .
  57. ^ Shen, Cenchao (2013). Maelezo ya jumla ya Teknolojia ya Mipango ya Polymerase iliyosaidiwa na Nanoparticle . Marekani: Wiley-Blackwell Publishing Ltd. pp. 97-106.
  58. ^ Horton RM, kuwinda HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR (1989). "Uhandisi wa jeni la mseto bila matumizi ya vikwazo vya enzymes: jeni inayochaguliwa na uingilizi wa maandishi". Gene . 77 (1): 61-68. Nini : 10.1016 / 0378-1119 (89) 90359-4 . PMID 2744488 .
  59. ^ Moller, Simon (2006). PCR (BASICS) . US: Taylor & Francis Group. p. 144.
  60. ^ David F, Turlotte E (1998). "Kuna njia ya amplification gene isotherme" [Mbinu ya Isothermal Amplification Method]. Akaunti ya Rendus de l'Académie des Sciences - Sura ya III - Sciences de la Vie . 321 (11): 909-914. do : 10.1016 / S0764-4469 (99) 80005-5 . ISSN 0764-4469 .
  61. ^ Fabrice David (Septemba-Oktoba 2002). "Matumizi ya propriétés topologiques ya ADN: un nouveau silaha dhidi ya mawakala pathogens" (PDF) . Fusion. Imehifadhiwa kutoka kwa asili (PDF) mnamo 2007-11-28. (kwa Kifaransa)
  62. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Nguvu KM, Behlke MA, Walder JA (Agosti 2011). "RNase H-tegemezi PCR (rhPCR): uboreshaji maalum na kutambua moja ya nucleotide polymorphism kwa kutumia vikwazo vilivyozuiwa" . BMC Bioteknolojia . 11: 80. doi : 10.1186 / 1472-6750-11-80 . PMC 3224242 Freely accessible . PMID 21831278 .
  63. ^ Shyamala, V .; Ferro-Luzzi, Ames G. (1993). "Single Specific Primer-Polymerase Makala Reaction (SSP-PCR) na Gome Walking". Mbinu katika Biolojia ya Masi . 15 : 339-48. Nini : 10.1385 / 0-89603-244-2: 339 . PMID 21400290 .
  64. ^ Bing DH, Boles C, Rehman FN, Audeh M, Belmarsh M, Kelley B, Adams CP (1996). "Kupanua daraja: mfumo wa PCR imara kwa ajili ya kukuza na kutambua tofauti za allelic katika jeni moja ya jenereta" . Majadiliano ya Maumbile ya Maumbile, Mkutano wa Saba wa Kimataifa wa Utambulisho wa Binadamu . Imehifadhiwa kutoka kwa asili awali ya 2001-05-07.
  65. ^ Khan Z, Poetter K, Park DJ (2008). "Kuimarisha awamu imara PCR: utaratibu wa kuongeza kukumbusha kwa wingi wa msaada wa imara". Analytical Biochemistry . 375 (2): 391-393. toa : 10.1016 / j.ab.2008.01.021 . PMID 18267099 .
  66. ^ Raoult, D; G Aboudharam; E Crubezy; G Larrouy; B Ludes; M Drancourt (2000-11-07). "Kitambulisho cha molekuli na" PCR ya kujiua "ya Yersinia pestis kama wakala wa kifo cha nyeusi cha medieval" . Proc. Natl. Chuo. Sci. USA . 97 (23): 12800-12803. doi : 10.1073 / pnas.220225197 . ISSN 0027-8424 . PMC 18844 Freely accessible . PMID 11058154 .
  67. ^ YG Liu & RF Whittier (1995). "PCR iliyoingilia kati ya joto isiyohamishika: kuimarisha automatiska na ufuatiliaji wa vipande vya mwisho vya kuingiza kutoka kwa pembe za P1 na YAC kwa kutembea kwa kromosomu". Genomics . 25 (3): 674-81. do : 10.1016 / 0888-7543 (95) 80010-J . PMID 7759102 .
  68. ^ Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (1991). " 'Touchdown' PCR kukwepa kuyumba priming wakati kujiongezea nguvu gene" . Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. hati : 10.1093 / nar / 19.14.4008 . PMC 328507 Freely accessible . PMID 1861999 .
  69. ^ Myrick KV, Gelbart WM (2002). "Universal Fast Walking kwa ajili ya uamuzi wa moja kwa moja na mchanganyiko wa mlolongo wa flanking". Gene . 284 (1-2): 125-131. doi : 10.1016 / S0378-1119 (02) 00384-0 . PMID 11891053 .
  70. ^ "Nakala Kamili - LaNe RAGE: chombo kipya cha uamuzi wa mlolongo wa DNA wa genomic" .
  71. ^ Park DJ (2005). "Mtaa mpya wa 5 wa murine GAPDH exon alitambua kutumia 5RARA LaNe". Bioteknolojia ya Masi . 29 (1): 39-46. Je : 10.1385 / MB: 29: 1: 39 . PMID 15668518 .
  72. ^ Park DJ (2004). "3ARACE LaNe: njia rahisi ya PCR iliyojaa kikamilifu ili kuamua mlolongo wa 3'-terminal cDNA". Biotechniques . 36 (4): 586-588, 590. PMID 15088375 .
  73. ^ Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (1971). "Uchunguzi juu ya polynucleotides XCVI.Kutengeneza majibu ya DNA ya muda mfupi kama kichocheo cha DNA polymerases". J. Mol. Biol . 56 (2): 341-361. Nini : 10.1016 / 0022-2836 (71) 90469-4 . PMID 4927950 .
  74. ^ Rabinow, Paul (1996). Kufanya PCR: Hadithi ya Bioteknolojia . Chicago: Chuo Kikuu cha Chicago Press. ISBN 0-226-70146-8 .
  75. ^ Mullis, Kary (1998). Kucheza Naked katika Field Mind . New York: Vitabu vya Pantheon. ISBN 0-679-44255-3 .
  76. ^ Mullis, Kary (1990). "Chanzo cha kawaida cha mmenyuko wa mnyororo wa polymerase". Scientific American . 262 (4): 56-61, 64-5. Je : 10.1038 / kisayansiamerican0490-56 . PMID 2315679 .
  77. ^ Patidar, Madhvika; Agrawal, Suraksha; Parveen, Farah; Khare, Parul (2015). "Maarifa ya molekuli ya mate katika kutatua mgogoro wa baba" . Journal ya Sayansi ya Maalum ya Matibabu . 7 (1): 76-79. do : 10.4103 / 0975-1475.150325 . ISSN 0975-1475 . PMC 4330625 Freely accessible . Iliondolewa Oktoba 8, 2017 .
  78. ^ Ushauri juu ya Jinsi ya kuishi Vita vya Taq ¶2: Ujumbe wa Uhandisi wa Geneti Mkuu - Biobusiness Channel: Kifungu. Mei 1, 2006 (Vol. 26, No. 9).

Viungo vya nje