Inafasiriwa moja kwa moja kutoka kwa Wikipedia ya Kiingereza na Tafsiri ya Google

Gel electrophoresis

Gel electrophoresis ni njia ya kujitenga na uchambuzi wa macromolecules ( DNA , RNA na protini ) na vipande vyao, kulingana na ukubwa wao na malipo. Inatumika katika kemia ya kliniki ili kutenganisha protini kwa malipo na / au ukubwa (upungufu wa IEF, kwa kawaida ukubwa huru) na katika biochemistry na biolojia ya molekuli kutenganisha idadi ya watu waliochanganywa ya vipande vya DNA na RNA kwa urefu, kukadiria ukubwa wa DNA na RNA vipande au kutenganisha protini kwa malipo. [1]

Gel electrophoresis
Gel electrophoresis vifaa.JPG
Gel electrophoresis vifaa - gel agarose ni kuwekwa katika buffer hii kujazwa sanduku na shamba umeme hutumiwa kwa njia ya umeme kwa nyuma. Terminal hasi ni mwisho wa mwisho (waya nyeusi), hivyo DNA huhamia kuelekea anode iliyoandaliwa kwa nguvu (waya nyekundu).
Uainishaji Electrophoresis
Mbinu nyingine
Kuhusiana Capillary electrophoresis
SDS-PAGE
Electrophoresis ya gel mbili-dimensional
Joto la mafuta ya gel electrophoresis


Picha ya digital ya 3 kizuizi cha plasmid kizuizi kinatumia gel ya 1% w / v agarose, 3 volt / cm, iliyosababishwa na bromidi ya ethidium. Kipimo cha ukubwa wa DNA ni ngazi ya kibiashara ya kbp 1. Msimamo wa visima na mwelekeo wa uhamiaji wa DNA umebainishwa.
Picha hapo juu inaonyesha jinsi vipande vidogo vya DNA vinavyohamia kupitia gel ya ugonjwa zaidi kuliko vipande vikubwa vya DNA wakati wa electrophoresis. Grafu upande wa kulia inaonyesha yasiyo ya nishati, uhusiano kati ya ukubwa wa kipande cha DNA na umbali uhamiaji.
Gel Electrophoresis ni mchakato ambapo sasa umeme hutumika kwa sampuli za DNA kujenga vipande vinavyoweza kutumika kwa kulinganisha kati ya sampuli za DNA.
1) DNA inatolewa.
2) Kutengwa na kukuza DNA.
3) DNA imeongezwa kwenye visima vya gel.
4) Umeme wa sasa hutumiwa kwa gel.
5) Bendi za DNA zinajitenga na ukubwa.
6) Bendi za DNA zimeharibiwa.





Nucleic asidi molekuli ni kutengwa kwa kutumia uwanja wa umeme kusonga molekuli kushtakiwa vibaya kwa njia ya tumbo ya ugarose au vitu vingine. Molekuli ndogo huhamia kwa kasi na kuhamia mbali zaidi kuliko hizo ndefu kwa sababu molekuli fupi huhamia kwa urahisi zaidi kupitia pole ya gel. Sifa hii inaitwa sieving. [2] Protini zinatenganishwa na malipo katika ugonjwa wa kupasuka kwa sababu pores ya gel ni kubwa mno kwa protini za sieve. Gel electrophoresis pia inaweza kutumika kwa ajili ya kutenganishwa kwa nanoparticles.

Gel electrophoresis inatumia gel kama kati ya anticonvective na / au sieving wakati wa electrophoresis, harakati ya chembe ya kushtakiwa katika uwanja wa umeme. Gels kuzuia convection mafuta unasababishwa na matumizi ya shamba umeme, na pia inaweza kufanya kama sieving kati, kurejesha kifungu cha molekuli; gels pia inaweza kutumika tu kudumisha mgawanyiko kumaliza, hivyo kwamba post electrophoresis stain inaweza kutumika. [3] DNA electrophoresis ya Gel hufanyika kwa madhumuni ya uchambuzi, mara nyingi baada ya kupanua DNA kupitia mmenyuko wa mnyororo wa polymerase (PCR), lakini inaweza kutumika kama mbinu ya maandalizi kabla ya kutumia njia nyingine kama vile spectrometry ya molekuli , RFLP , PCR, cloning , Ufuatiliaji wa DNA , au kusubiri Kusini kwa sifa zaidi.

Yaliyomo

Kimwili misingi

Maelezo ya jumla ya Electrophoresis ya Gel.

Kwa maneno rahisi, electrophoresis ni mchakato unaowezesha kutengeneza molekuli kulingana na ukubwa. Kutumia uwanja wa umeme, molekuli (kama vile DNA) zinaweza kufanywa kupitia gel ya agar au polyacrylamide . Sehemu ya umeme ina malipo mabaya kwenye mwisho mmoja ambayo inasukuma molekuli kupitia gel, na malipo mazuri kwa upande mwingine ambayo huvuta molekuli kupitia gel. Molekuli zinazopangwa hutolewa kwenye kisima kwenye vifaa vya gel. Gel imewekwa kwenye chumba cha electrophoresis, ambacho kinashiriki kwenye chanzo cha nguvu. Wakati umeme wa sasa unatumika, molekuli kubwa huenda polepole zaidi kupitia gel wakati molekuli ndogo huenda kwa kasi. Molekuli tofauti mbalimbali huunda bendi tofauti kwenye gel. [ citation inahitajika ]

Neno " gel " katika suala hili linamaanisha matrix inayotumiwa kuwa na, kisha tofauti na molekuli ya lengo. Katika hali nyingi, gel ni polymer iliyosababishwa ambayo muundo na porosity huchaguliwa kulingana na uzito maalum na muundo wa lengo la kuchambuliwa. Kutenganisha protini au asidi ndogo za nucleic ( DNA , RNA , au oligonucleotides ) gel mara nyingi hujumuisha viwango tofauti vya acrylamide na msalaba-kuunganisha , huzalisha mitandao tofauti ya mesh ya polyacrylamide. Wakati wa kutenganisha asidi kubwa ya nucleic (kubwa kuliko besi mia chache), tumbo la kupendekezwa linajitakasa. Katika matukio hayo mawili, gel huunda tumbo imara, lakini bado inajitokeza. Acrylamide, kinyume na polyacrylamide, ni neurotoxini na inapaswa kushughulikiwa kwa kutumia tahadhari sahihi za usalama ili kuepuka sumu. Agarose linajumuisha minyororo isiyokuwa na ukombozi wa kabohaidrati isiyojali bila viungo vya msalaba kusababisha gel na pores kubwa zinazowezesha kujitenga kwa macromolecules na complexes macromolecular . [ citation inahitajika ]

Electrophoresis inahusu nguvu ya umeme (EMF) ambayo hutumiwa kuhamisha molekuli kupitia tumbo la gel. Kwa kuweka molekuli katika visima kwenye gel na kutumia shamba la umeme, molekuli zitapita kupitia tumbo kwa viwango tofauti, imetambuliwa kwa kiasi kikubwa na wingi wao wakati uwiano wa malipo kwa-wingi wa aina zote ni sare. Hata hivyo, wakati mashtaka sio sare zote basi, uwanja wa umeme unaotokana na utaratibu wa electrophoresis utaathiri aina zilizo na mashtaka tofauti na kwa hiyo zitavutia aina kulingana na mashtaka yao yaliyo kinyume. Aina ambazo zinatakiwa kushtakiwa zitahamia kuelekea kwenye cathode ambayo inashtakiwa vibaya (kwa sababu hii ni electrolytic badala ya seli ya galvanic ). Ikiwa aina hiyo inashtakiwa vibaya watahamia kuelekea anode iliyoandaliwa kwa uzuri. [4]

Ikiwa sampuli kadhaa zimewekwa kwenye visima vya karibu kwenye gel, zitatembea sawa na njia za kibinafsi. Kulingana na idadi ya molekuli tofauti, kila mstari unaonyesha kutenganishwa kwa vipengele kutoka kwa mchanganyiko wa awali kama bendi moja au zaidi tofauti, bendi moja kwa kila sehemu. Ugawanyiko usio kamili wa vipengele unaweza kusababisha vifungo vilivyoingiliana, au smears isiyojulikana inayowakilisha vipengele vingi visivyoweza kubadilishwa. [ funguo zinahitajika ] Bendi katika njia tofauti zinazofikia umbali sawa kutoka juu zina molekuli zilizopita kupitia gel kwa kasi sawa, ambayo kwa kawaida inamaanisha kuwa ni sawa na ukubwa sawa. Kuna alama za ukubwa wa uzito inapatikana ambayo yana mchanganyiko wa molekuli ya ukubwa unaojulikana. Ikiwa alama hiyo iliendeshwa kwenye njia moja kwenye gel sambamba na sampuli zisizojulikana, bendi zilizingatiwa zinaweza kulinganishwa na wale wasiojulikana ili kuamua ukubwa wao. Umbali wa safari ya bendi ni takriban inversely sawa na logarithm ya ukubwa wa molekuli. [ citation inahitajika ]

Kuna mipaka ya mbinu za electrophoretic. Kwa kuwa kupita sasa kupitia gel husababisha joto, gel inaweza kuyeyuka wakati wa electrophoresis. Electrophoresis hufanyika katika ufumbuzi wa buffer ili kupunguza pH mabadiliko kutokana na uwanja wa umeme, ambayo ni muhimu kwa sababu malipo ya DNA na RNA hutegemea pH, lakini kukimbia kwa muda mrefu sana kunaweza kutosha uwezo wa ufumbuzi. Pia kuna mapungufu katika kuamua uzito wa Masi na SDS-PAGE, hasa kama unatafuta kupata MW ya protini isiyojulikana. Kuna baadhi ya vigezo vya kibiolojia ambazo ni vigumu au haiwezekani kupunguza na zinaweza kuathiri uhamiaji wa electrophoretic. Mambo hayo ni pamoja na muundo wa protini, marekebisho ya baada ya kutafsiri, na muundo wa amino asidi. Kwa mfano, tropomyosin ni protini tindikali ambayo huhamia kwa kawaida kwenye gesi SDS-PAGE. Hii ni kwa sababu mabaki ya acidi yanakabiliwa na SDS iliyosababishwa kwa uharibifu, na kusababisha uwiano usio sahihi na uhamiaji. [5] Zaidi ya hayo, maandalizi tofauti ya nyenzo za maumbile hawezi kuhama mara kwa mara kwa kila mmoja, kwa sababu za kimaadili au nyingine.

Aina ya Gel

Aina za gel ambazo hutumiwa kawaida ni gesi na polyacrylamide. Kila aina ya gel inafaa kwa aina tofauti na ukubwa wa analyte. Gels ya polyacrylamide hutumiwa kwa protini, na huwa na uwezo mkubwa wa kutatua kwa vipande vidogo vya DNA (5-500 bp). Gels ya agarose kwa upande mwingine huwa na nguvu za chini za kutatua DNA lakini zina tofauti zaidi, na hivyo hutumiwa kwa vipande vya DNA vya kawaida kwa kawaida 50-2,000,000, lakini azimio la zaidi ya 6 Mb inawezekana kwa electrophoresis ya gel ya pulsed shamba (PFGE ). [6] Polyacrylamide jeli zinaendeshwa katika usanidi wima wakati jeli agarose ni kawaida kukimbia sambamba katika hali ya meli. Pia hutofautiana katika mbinu zao za kutengeneza, kama ugarose huweka thermally, wakati polyacrylamide inavyofanya katika mmenyuko wa upolimishaji wa kemikali.

Agarose

Gels ya agarose hufanywa kutoka kwa polima ya polysaccharide ya asili iliyotokana na baharini . Gel ya agarose hupigwa na kushughulikiwa kwa urahisi ikilinganishwa na matrices mengine, kwa sababu mazingira ya gel ni mabadiliko ya kimwili badala ya kemikali. Sampuli pia zinapatikana kwa urahisi. Baada ya jaribio hilo limekamilishwa, gel kusababisha huweza kuhifadhiwa kwenye mfuko wa plastiki kwenye jokofu.

Magera ya Agarose hawana ukubwa wa pore sare, lakini ni sawa kwa electrophoresis ya protini ambazo ni kubwa kuliko 200 kDa. [7] Electrophoresis ya gel ya agarose pia inaweza kutumika kwa ajili ya kutenganishwa kwa vipande vya DNA kuanzia jozi ya msingi ya 50 hadi megabasi kadhaa (mamilioni ya besi), ambayo ni kubwa zaidi ambayo yanahitaji vifaa maalumu. Umbali kati ya bendi za DNA za urefu tofauti huathiriwa na asilimia ya ugonjwa katika gel, na asilimia kubwa inayohitaji nyakati za kukimbia, wakati mwingine. Badala yake, kiwango cha juu cha asilimia ya agarose kinapaswa kuendeshwa na electrophoresis (PFE) ya shamba iliyopangwa , au electrophoresis ya inversion ya shamba .

"Gels nyingi za ugonjwa hutengenezwa na kati ya 0.7% (kujitenga vizuri au azimio la vipande vingi vya DNA 5-10kb) na 2% (azimio nzuri kwa vipande vidogo vya 0.2-1kb) ugarose kufutwa katika buffer ya electrophoresis. kutenganisha vipande vidogo sana lakini gel ya wima ya polyacrylamide inafaa zaidi katika kesi hii. Asilimia ya chini ya gel ni dhaifu sana na inaweza kuvunja wakati unapojaribu kuinua.Wengi asilimia gels mara nyingi hupungua na haipaswi sawa. maombi mengi. " [8]

Polyacrylamide

Electrophoresis ya gesi ya polyacrylamide (PAGE) hutumiwa kutenganisha protini zinazoanzia ukubwa kutoka kwa kDa 5 hadi 2,000 kutokana na ukubwa wa pore ukubwa unaotolewa na gel polyacrylamide. Ukubwa wa Pore hudhibitiwa kwa kuimarisha viwango vya poda ya acrylamide na bis-acrylamide kutumika katika kujenga gel. Care lazima kutumika wakati wa kujenga aina hii ya gel, kama acrylamide ni neurotoxin yenye nguvu katika maji yake na aina ya poda.

DNA za jadi za ufuatiliaji kama vile Maxam-Gilbert au mbinu za Sanger zinazotumia gesi za polyacrylamide ili kutofautisha vipande vya DNA tofauti na jozi moja ya msingi kwa hivyo mlolongo unaweza kusomwa. Mbinu nyingi za kujitenga za DNA za kisasa sasa hutumia gel za agarose, ila kwa vipande vidogo vya DNA. Kwa sasa hutumiwa mara nyingi katika uwanja wa uchambuzi wa immunology na protini, mara nyingi hutumiwa kutenganisha protini tofauti au isoforms ya protini sawa katika bendi tofauti. Hizi zinaweza kuhamishiwa kwenye membrane ya nitrocellulose au PVDF ili kutumiwa na antibodies na alama zinazofanana, kama vile blot magharibi .

Gel kutatua kawaida hufanywa kwa 6%, 8%, 10%, 12% au 15%. Kuhifadhi gel (5%) hutiwa juu ya gel ya kutatua na kuchana gel (ambayo huunda visima na kufafanua njia ambazo protini, buffer ya sampuli na ladders zitawekwa) huingizwa. Asilimia iliyochaguliwa inategemea ukubwa wa protini ambayo mtu anataka kutambua au kuchunguza katika sampuli. Kidogo cha uzito unaojulikana, asilimia ya juu ambayo inapaswa kutumika. Mabadiliko kwenye mfumo wa gel ya gel inaweza kusaidia kutatua zaidi protini za ukubwa mdogo sana. [9]

Kusanya

Kiasi hydrolysed viazi wanga hufanya mwingine wa kati mashirika yasiyo ya sumu kwa protini electrophoresis. Gels ni opaque kidogo kuliko acrylamide au ugarose. Protini zisizo na dalili zinaweza kutengwa kulingana na malipo na ukubwa. Wao ni visualized kutumia Napthal Black au Amido Black staining. Viwango vya aina ya gel ya kawaida ni 5% hadi 10%. [10] [11] [12]

Hali ya Gel

Kuonyesha

TTGE maelezo yaliyodhihirisha tofauti ya bifidobacterial ya sampuli za fecal kutoka kwa kujitolea wawili wenye afya (A na B) kabla na baada ya AMC (Oral Amoxicillin-Clavulanic Acid) matibabu

Kutangaza gels huendeshwa chini ya hali ambazo zinaharibu muundo wa asili wa wachambuzi, na husababisha kufunguliwa kwenye mstari wa mstari. Hivyo, uhamaji wa kila macromolecule inategemea tu urefu wake wa mstari na uwiano wake wa misaada. Hivyo, viwango vya sekondari, vya juu, na vya quaternary vya muundo wa biomolecular vimechanganyikiwa, na kuacha tu muundo wa msingi kuchambuliwa.

Nucleic asidi mara nyingi huchapishwa kwa kutumia urea katika buffer, wakati protini zinatengenezwa kwa kutumia dodecyl sulfate ya sodiamu , kwa kawaida kama sehemu ya mchakato wa SDS-PAGE . Kwa dalili kamili ya protini, ni muhimu pia kupunguza vifungo vingi vya disulfide ambavyo vinasimamisha muundo wao wa juu na wa quaternary , njia inayoitwa kupunguza PAGE. Kupunguza hali kwa kawaida huhifadhiwa na kuongeza ya beta-mercaptoethanol au dithiothreitol . Kwa uchambuzi wa jumla wa sampuli za protini, kupunguza PAGE ni aina ya kawaida ya electrophoresis ya protini .

Kutangaza hali ni muhimu kwa makadirio sahihi ya uzito Masi wa RNA. RNA ina uwezo wa kuingiliana zaidi ya intramolecular kuliko DNA ambayo inaweza kusababisha mabadiliko ya uhamaji wake wa electrophoretic . Urea , DMSO na glyoxal ni mawakala wa kudanganya mara nyingi hutumiwa kuharibu mfumo wa RNA. Mwanzoni, hidroksidi ya methylmercury yenye sumu kali mara nyingi ilitumiwa katika kudanganya electrophoresis ya RNA, [13] lakini inaweza kuwa njia ya kuchagua kwa sampuli fulani. [14]

Kutangaza electrophoresis ya gel hutumiwa katika njia ya muundo wa DNA na RNA banding-based based gradient gel electrophoresis (TGGE) [15] na kuthibitisha electrophoresis gel gradient (DGGE). [16]

Native

Madoa maalum yanayohusiana na enzyme: Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase isoenzymes katika Plasmodium falciparum imeambukizwa seli za damu nyekundu [17]

Gels asili ni kukimbia katika hali isiyo ya kutangaza, hivyo muundo wa asili ya analyte ni iimarishwe. Hii inaruhusu ukubwa wa kimwili wa ngumu iliyokusanywa au iliyokusanyika ili kuathiri uhamaji, kuruhusu uchambuzi wa ngazi zote nne za muundo wa biomolecular. Kwa sampuli za kibaiolojia, sabuni hutumiwa tu kwa kiwango ambacho ni muhimu kwa kuzungumzia membrane ya lipid katika kiini . Complexes kubaki-kwa sehemu nyingi-kuhusishwa na kupakuliwa kama wangekuwa katika kiini. Kikwazo kimoja, hata hivyo, ni kwamba tata haiwezi kutenganisha kwa usafi au kutabiri, kwa kuwa vigumu kutabiri jinsi sura na ukubwa wa molekuli itaathiri uhamaji wake. Kushughulikia na kutatua tatizo hili ni lengo kuu la PAGE ya asili ya kiasi .

Tofauti na njia za kudanganya, electrophoresis ya asili ya gel haitumii wakala wa kuthibitisha . Molekuli zinazoteuliwa (kwa kawaida protini au asidi ya nucleic ) hutofautiana tu katika molekuli ya molekuli na malipo ya ndani, lakini pia eneo la msalaba, na hivyo hupata nguvu tofauti za electrophoretic inategemea sura ya muundo wa jumla. Kwa protini, kwa kuwa wanabaki katika hali ya asili wanaweza kuwa visualized si tu kwa jumla ya protini stainless reagents lakini pia na maalum enzyme-kuhusishwa staining.

Mfano maalum wa majaribio ya matumizi ya electrophoresis ya asili ya gel ni kuangalia shughuli za enzymatic kuthibitisha uwepo wa enzyme katika sampuli wakati wa utakaso wa protini. Kwa mfano, kwa phosphatase ya alkali phosphatase, ufumbuzi wa madhara ni mchanganyiko wa chumvi 4-chloro-2-2methylbenzenediazonium na asidi 3-phospho-2-naphthoic asidi-2'-4'-dimethyl aniline katika buffer Tris. Taa hii ni kuuzwa kwa biashara kama kit kwa ajili ya kutafisha gels. Ikiwa protini iko, utaratibu wa majibu hufanyika kwa utaratibu wafuatayo: huanza na de-phosphorylation ya 3-phospho-2-naphthoic asidi-2'-4'-dimethyl aniline na phosphatase ya alkali (maji inahitajika kwa majibu). Kikundi cha phosphate hutolewa na kubadilishwa na kikundi cha pombe kutoka kwa maji. Electrophile 4- chloro-2-2 methylbenzenediazonium (chumvi haraka ya TR Diazonium) hupanda kikundi cha pombe ambacho kinafanya rangi ya mwisho ya Azo rangi. Kama jina lake linamaanisha, hii ndiyo bidhaa ya mwisho inayoonekana ya majibu. Katika majaribio ya kitaaluma ya kujitengeneza kwa protini, gel kawaida hukimbia karibu na sampuli zilizosafishwa za biashara ili kuonesha matokeo na kuchanganya kama usafi au utakaso ulifanikiwa. [18]

Native gel electrophoresis ni kawaida kutumika katika proteomics na metallomics . Hata hivyo, PAGE ya asili pia hutumia jaribio la jeni (DNA) kwa mabadiliko ya haijulikani kama katika Kipimo cha single-strand conformation polymorphism .

Buffers

Buffers katika electrophoresis ya gel hutumiwa kutoa ions zinazobeba sasa na kudumisha pH kwa thamani ya mara kwa mara. Vipindi hivi vinakuwa na ions nyingi ndani yao, ambayo ni muhimu kwa njia ya umeme kupitia yao. Kitu kama maji yaliyotengenezwa au benzini ina ions chache, ambayo sio bora kwa matumizi katika electrophoresis. [19] Kuna idadi ya buffers kutumika kwa electrophoresis. Aina ya kawaida, kwa asidi ya nucleic Tris / Acetate / EDTA (TAE), Tris / Borate / EDTA (TBE). Vipindi vingine vingi vimependekezwa, kwa mfano, lithiamu borate , ambayo haijawahi kutumiwa, kwa kuzingatia vyema vya Pubmed (LB), iso yake ya umeme ya umeme, pK ya bidhaa zinazofanana, nk; mara nyingi matarajio yaliyotakiwa ni ya chini (chini ya joto) na yanayolingana na uwezo wa ion, unaosababisha maisha ya muda mrefu. Borate ni tatizo; Borate inaweza kuimarisha, na / au kuingiliana na cis diols kama vile zilizopatikana katika RNA. TAE ina uwezo wa kupungua chini lakini hutoa azimio bora kwa DNA kubwa. Hii ina maana ya voltage ya chini na muda zaidi, lakini bidhaa bora. LB ni mpya na haina ufanisi katika kutatua vipande vikubwa kuliko kbp 5; Hata hivyo, kwa conductivity yake ya chini, voltage ya juu sana inaweza kutumika (hadi 35 V / cm), ambayo ina maana ya muda mfupi uchambuzi wa electrophoresis kawaida. Tofauti ya chini ya ukubwa wa jozi ya msingi inaweza kutatuliwa katika gel ya 3% ya ugonjwa na kiwango cha chini cha conductivity (1 mM Lithium borate). [20]

Wengi wa vipindi vya protini vya SDS-PAGE hufanyika kwa kutumia mfumo wa "discontinuous" (au DISC) ambao unasaidia sana ukubwa wa bendi ndani ya gel. Wakati wa electrophoresis katika mfumo wa gel unaoacha, kiini cha ion kinapatikana katika hatua ya mwanzo ya electrophoresis ambayo inasababisha protini zote kuzingatia bendi moja mkali katika mchakato unaoitwa isotachophoresis . Kugawanyika kwa protini kwa ukubwa kunapatikana katika eneo la chini, "kutatua" la gel. Gel ya kutatua kawaida ina ukubwa mdogo wa pore, ambayo husababisha athari ya sieving ambayo sasa huamua uhamaji wa electrophoretic wa protini.

Visualization

Baada ya electrophoresis kukamilika, molekuli katika gel inaweza kubadilika ili kuwafanya iwe wazi. DNA inaweza kutafakari kwa kutumia bromidi ya ethidium ambayo, wakati wa kuingiliana ndani ya DNA, fluoresce chini ya mwanga wa ultraviolet , wakati protini inaweza kuwa visualized kwa kutumia taa ya fedha au Coomassie Brilliant Blue rangi. Njia nyingine pia zinaweza kutumiwa kutazama kutenganishwa kwa vipengele vya mchanganyiko kwenye gel. Ikiwa molekuli zitatenganishwa zina vyenye radioactivity , kwa mfano katika gel ya ufuatiliaji wa DNA , autoradiogram inaweza kuwa kumbukumbu ya gel. Picha zinaweza kuchukuliwa kwa gel, mara nyingi kutumia mfumo wa Gel Doc .

Usindikaji wa chini wa

Baada ya kutenganishwa, njia ya kujitenga ya ziada inaweza kutumika, kama vile kulenga isoelektri au SDS-PAGE . Gel itakuwa kisha kukatwa kimwili, na complexes protini kuondolewa kutoka kila sehemu tofauti. Dondoo moja inaweza kisha kuchambuliwa, kama vile peptide mass fingerprinting au de novo peptide sequencing baada ya gel-digestion . Hii inaweza kutoa taarifa nyingi kuhusu utambulisho wa protini katika ngumu.

Maombi

  • Upimaji wa ukubwa wa molekuli za DNA zifuatazo kizuizi cha enzyme kizuizi, kwa mfano katika ramani ya kizuizi cha DNA iliyosababishwa.
  • Uchambuzi wa bidhaa za PCR , kwa mfano katika uchunguzi wa maumbile ya Masi au uchapishaji wa kidole
  • Ugawanyiko wa DNA ya uharibifu kabla ya uhamisho wa Kusini , au ya RNA kabla ya uhamisho wa kaskazini .

Gel electrophoresis hutumiwa katika forensics , biolojia ya molekuli , genetics , microbiology na biochemistry . Matokeo yanaweza kuchambuliwa kwa kiasi kikubwa kwa kutazama gel na mwanga wa UV na kifaa cha picha ya gel. Sura hiyo imeandikwa kwa kamera iliyoendeshwa na kompyuta, na ukubwa wa bendi au doa ya riba hupimwa na ikilinganishwa na kiwango au alama zilizowekwa kwenye gel sawa. Upimaji na uchambuzi hufanywa kwa programu maalumu.

Kulingana na aina ya uchambuzi unaofanywa, mbinu nyingine hutumiwa kwa pamoja na matokeo ya electrophoresis ya gel, na hutoa maombi mbalimbali ya shamba.

Nucleic asidi

Gel ya agarose ya bidhaa ya PCR ikilinganishwa na ngazi ya DNA.

Katika kesi ya asidi nucleic, mwelekeo wa uhamiaji, kutoka kwa hasi hadi kwa electrodes chanya, ni kutokana na malipo ya asili ya kawaida yanayotokana na uti wa mgongo wa sukari - phosphate . [21]

Vipande viwili vya DNA vilivyopangwa kwa kawaida hutenda kama vifungo vya muda mrefu, hivyo kuhamia kwao kupitia gel ni sawa na ukubwa wao au, kwa vipande vya mzunguko, radius ya kuingia . DNA ya Circular kama vile plasmids , hata hivyo, inaweza kuonyesha bendi nyingi, kasi ya uhamiaji inaweza kutegemeana ikiwa imechelewa au imechukuliwa. DNA au RNA moja iliyopunjwa huwa inaendelea kuingia kwenye molekuli na maumbo tata na kuhamia kupitia gel kwa njia ngumu kulingana na muundo wao wa juu. Kwa hiyo, mawakala ambao huharibu vifungo vya hidrojeni , kama vile hidroksidi ya sodiamu au formamide , hutumiwa kuthibitisha asidi za nucleic na kuwafanya waweze kuishi kama viboko vingi tena. [22]

Gel electrophoresis ya DNA kubwa au RNA kawaida hufanyika na electrophoresis ya gel kali. Angalia ukurasa wa " njia ya kukamilisha mlolongo " kwa mfano wa DNA ya polyacrylamide ugawaji gel. Tabia kwa njia ya mwingiliano wa ligand ya asidi ya nyuklia au vipande vinaweza kufanywa na uhamaji kuhama electrophoresis .

Electrophoresis ya sampuli za RNA zinaweza kutumiwa kuchunguza uchafuzi wa DNA ya jeni na pia uharibifu wa RNA. RNA kutoka kwa viumbe vya eukaryotic inaonyesha bendi tofauti za 28 na 18 za rRNA, bandari ya 28 ya kuwa takribani mara mbili kali kama bandari ya 18. RNA iliyoharibika ina bendi ndogo zilizoelezwa kwa kasi, inaonekana kuonekana, na kiwango cha uwiano ni chini ya 2: 1.

protini

SDS-UKURASA autoradiography - protini unahitajika sasa katika viwango tofauti katika sampuli mbili.

Protini , tofauti na asidi za nyuklia, zinaweza kuwa na mashtaka tofauti na maumbo mazuri, kwa hiyo haziwezi kuhamia kwenye gel ya polyacrylamide kwa viwango vilivyo sawa, au wakati wote, wakati wa kuweka msimamo hasi kwa EMF kwenye sampuli. Protini hiyo, ni kawaida denatured mbele ya sabuni kama vile sodium sulfate dodecyl (SDS) kwamba nguo protini na chaji hasi. [3] Kwa ujumla, kiwango cha SDS kilichofungwa kinahusiana na ukubwa wa protini (kawaida 1.4g SDS kwa gramu ya protini), ili protini zilizoharibika zimejaa malipo mabaya, na protini zote zina malipo sawa- kwa uwiano wa wingi. Tangu protini zilizopangwa zinafanya kama viboko vya muda mrefu badala ya kuwa na sura ya juu ya kiwango cha juu, kiwango ambacho SDS ambacho husababisha protini zilizochomwa huhamia kwenye gel ni jamaa tu kwa ukubwa wake na sio malipo au sura yake. [3]

Kwa kawaida, protini huchambuliwa na electrophoresis ya gel ya dodecyl sulfate polyacrylamide ( SDS-PAGE ), na electrophoresis ya asili ya gel , na electrophoresis ya gel ya maandalizi ( QPNC-PAGE ), au electrophoresis ya 2-D .

Tabia kwa njia ya mwingiliano wa ligand inaweza kufanywa na electroblotting au kwa electrophoresis ya ubinafsi katika ugarose au kwa capillary electrophoresis kama kwa makadirio ya constants binding na uamuzi wa makala ya kimuundo kama maudhui glycan kwa njia ya lectin binding.

Historia

Electropherogram inayoonyesha PETU nne inaendesha protini ya chromatografia ya asili ya chromatographically iliyopangwa (≈ 200 ku) kama kazi ya muda wa upolimishaji wa gel (4% T, 2.67% C).
  • 1930 - Taarifa ya kwanza ya matumizi ya sucrose kwa electrophoresis ya gel
  • 1955 - kuanzishwa kwa gel za wanga , kujitenga kwa kiasi kikuu (Smithies) [11]
  • 1959 - kuanzishwa kwa gel acrylamide; electrophoresis ya disc (Ornstein na Davis); udhibiti sahihi wa vigezo kama ukubwa wa pore na utulivu; na (Raymond na Weintraub)
  • 1966 - matumizi ya kwanza ya gel agar [23]
  • 1969 - kuanzishwa kwa mawakala wa kudanganya hasa SDS kutenganishwa kwa protini subunit (Weber na Osborn) [24]
  • 1970 - Laemmli ilitenganisha vipengele 28 vya phaji la T4 kwa kutumia gel ya stacking na SDS
  • 1972 - gel agarose na stadium ethidium bromide stain [25]
  • 1975 - gels 2-dimensional (O'Farrell); isoelectric kulenga kisha SDS gel electrophoresis
  • 1977 - sequencing gels
  • 1983 - electrophoresis gel shamba pulled shamba huwezesha kujitenga molekuli kubwa DNA
  • 1983 - kuanzishwa kwa electrophoresis ya capillary
  • 2004 - muda uliowekwa wa upolimishaji wa gel acrylamide huwezesha kujitenga safi na kutabirika ya protini za asili (Kastenholz) [26]

Kitabu cha 1959 juu ya electrophoresis na Milan Bier kinasema kumbukumbu kutoka miaka ya 1800. [27] Hata hivyo, Oliver Smithies alifanya michango muhimu. Bier inasema: "Njia ya Smithies ... ni kutafuta maombi kwa sababu ya nguvu yake ya kipekee ya kujitenga." Kuchukuliwa katika mazingira, Bier inamaanisha kwamba njia ya Smithies 'ni kuboresha.

Tazama pia

  • Programu ya uchambuzi wa gel 2D
  • Historia ya electrophoresis
  • Uhamiaji wa electrophoretic hubadilika
  • Gel uchimbaji
  • Kuzingatia maelekezo
  • Pulsed shamba gel electrophoresis
  • Electrophoresis ya gel mbili-dimensional
  • SDD-AGE
  • Zymography
  • Proteolysis ya haraka sambamba [28]

Marejeleo

  1. ^ Kryndushkin DS, IM Alexandrov, MD Ter-Avanesyan, Kushnirov VV (2003). "Mchuu wa PSI +] hutengenezwa na polima ndogo za Sup35 zilizogawanywa na Hsp104". Journal ya kemia ya kibaiolojia . 278 (49): 49636-43. doi : 10.1074 / jbc.M307996200 . PMID 14507919 .
  2. ^ Sambrook J, Russel DW (2001). Cloning ya Masi: Mwongozo wa Maabara ya 3 Ed. Waandishi wa Maabara ya Maabara ya Cold Spring Harbor. Hifadhi ya Cold Spring, NY.
  3. ^ B c Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2002). Biochemistry (5th ed.). WH Freeman. ISBN 0-7167-4955-6 .
  4. ^ Robyt, John F .; Nyeupe, Bernard J. (1990). Mbinu za Biochemical Nadharia na Mazoezi . Waandishi wa Waveland. ISBN 0-88133-556-8 .
  5. ^ "Uamuzi wa Uzito wa Masi na SDS-PAGE" (PDF) .
  6. ^ Tom Maniatis; EF Fritsch; Joseph Sambrook. "Sura ya 5, itifaki ya 1". Cloning ya Masi - Mwongozo wa Maabara . 1 (3rd ed.). p. 5.2-5.3. ISBN 978-0879691363 .
  7. ^ Smisek, DL; Hoagland, DA (1989). "Agarose gel electrophoresis ya uzito wa juu Masi, polyelectrolytes synthetic". Macromolecules . 22 (5): 2270-2277. Bibcode : 1989MaMol..22.2270S . Je : 10.1021 / ma00195a048 .
  8. ^ "Agarose gel electrophoresis (njia ya msingi)" . Protocols ya Biolojia . Iliondolewa Agosti 23, 2011 .
  9. ^ Schägger, Hermann (2006). "Tricine-SDS-PAGE". Protocols ya asili . 1 (1): 16-22. do : 10.1038 / nprot.2006.4 . PMID 17406207 .
  10. ^ Gordon, AH (1975). Electrophoresis ya protini katika polyacrylamide na gel ya wanga . New York: American Elsevier Publishing Company, Inc.
  11. ^ B Smithies, O. (1955). "Eneo la electrophoresis katika gels ya wanga: tofauti ya vikundi katika protini za seramu za watu wazima wa kawaida" . Biochem. J. 61 (4): 629-641. PMC 1215845 Freely accessible . PMID 13276348 .
  12. ^ Wraxall, BGD; Culliford, BJ (1968). "Njia ya gel ya safu nyembamba ya aina ya enzyme kuandika damu". J. Forensic Sci. Soka . 8 (2): 81-82. Je : 10.1016 / S0015-7368 (68) 70449-7 . PMID 5738223 .
  13. ^ Buell, GN; Wickens, mbunge; Payvar, F; Schimke, RT (Apr 10, 1978). "Uchanganuzi wa cDNA kamili ya urefu kutoka mRNA za sehemu nne za utambulisho". Journal ya Kemia ya Kemikali . 253 (7): 2471-82. PMID 632280 .
  14. ^ Schelp, C; Kaaden, OR (Mei 1989). "Kurekebishwa kwa urefu kamili wa Sindbis virusi RNA na denaturation bora na methylmercury hidroksidi". Acta virologica . 33 (3): 297-302. PMID 2570517 .
  15. ^ Fromin N., Hamelin J., Tarnawski S., Roesti D., Jourdain-Miserez K., Forestier N., Teyssier-Cuvelle S., Gillet F., Aragno M. na Rossi P. (2002) Takwimu uchambuzi wa kuthibitisha electrophoresis ya gel (DGE) ya chati za kidole. E + nviron Microbiol 4: 634-643.
  16. ^ Simu. 1979 Jan; 16 (1): 191-200. Ugawanyiko wa muda mrefu wa kujitegemea wa vipande vya kizuizi vya DNA katika electrophoresis ya gel mbili-dimensional. Fischer SG, Lerman LS
  17. ^ Hempelmann E, Wilson RJ (1981). "Kugundua deludose-6-phosphate dehydrogenase katika vimelea vya malaria" . Parasitology ya Masi na Biochemical . 2 (3-4): 197-204. Je : 10.1016 / 0166-6851 (81) 90100-6 . PMID 7012616 .
  18. ^ Ninfa, Ballou, Kabla (1998). Mbinu kuu ya Biolojia na Bioteknolojia . Bethesda, Md: Fitzgerald Science Press.
  19. ^ Ninfa, Alexander J .; Ballou, David P .; Benore, Marilee (2009). mbinu za msingi za maabara ya biochemistry na bioteknolojia . Hoboken, NJ: Wiley. p. 161. ISBN 0470087668 .
  20. ^ Brody JR, Kern SE (Oktoba 2004). "Historia na kanuni za vyombo vya habari vya uendeshaji kwa electrophoresis ya kawaida ya DNA" (PDF) . Anal. Biochem . 333 (1): 1-13. Je : 10.1016 / j.ab.2004.05.054 . PMID 15351274 .
  21. ^ Hifadhi H; Berk A; Matsudaira P (2004). Biolojia ya Kiini ya Masi (5th ed.). WH Freeman: New York, NY. ISBN 978-0-7167-4366-8 .
  22. ^ Ufumbuzi wa matatizo ya DNA electrophoresis ya gel agarose. Mkazo wa 19: 3 p. 66 (1997).
  23. ^ Thorne HV (1966). "Kutenganishwa kwa electrophoretic ya DNA ya virusi ya DNA kutoka kwa DNA ya jeshi la mwenyeji". Virology . 29 (2): 234-9. do : 10.1016 / 0042-6822 (66) 90029-8 . PMID 4287545 .
  24. ^ Weber, K; Osborn, M (1969). "Kuaminika kwa uamuzi wa uzito wa Masi na electrophoresis ya delecyl sulfate-polyacrylamide gel". Journal ya Kemia ya Kemikali . 244 (16): 4406-12. PMID 5806584 .
  25. ^ Aaij C, Borst P (1972). "Electrophoresis ya gel ya DNA". Biochim Biophys Acta . 269 (2): 192-200. Nini : 10.1016 / 0005-2787 (72) 90426-1 . PMID 5063906 .
  26. ^ Kastenholz B (2004). "Maandalizi ya asili ya polyacrylamide ya gel electrophoresis (PNC-PAGE): njia bora ya kutenganisha cofactors ya cadmium katika mifumo ya kibiolojia". Barua za Uchambuzi . 37 (4): 657-665. do : 10.1081 / AL-120029742 .
  27. ^ Milan Bier (ed.) (1959). Electrophoresis. Nadharia, Mbinu na Maombi (edhari ya 3 ya uchapishaji). Chuo cha Habari. p. 225. OCLC 1175404 . LCC 59-7676.
  28. ^ Mpi DP (2012). "Kuamua uimarishaji wa protini ya biophysical katika lysates na ufuatiliaji wa haraka wa proteolysis, FASTpp" . PLOS ONE . 7 (10): e46147. Bibcode : 2012PLoSO ... 746147M . Je : 10.1371 / jarida.pone.0046147 . PMC 3463568 Freely accessible . PMID 23056252 .

Viungo vya nje